施万细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
2017-06-09 伊文 中国骨与关节杂志
随着现代交通的发展，脊髓损伤(SCI)已经成为常见的外伤性疾病，可导致中枢神经系统感觉运动功能障碍且不可逆，造成截瘫或四肢瘫，从而严重影响患者的日常生活和生存质量。其并发症的发生也会是致命的威胁并大大加重患者的家庭负担，例如膀胱和直肠功能障碍、心血管系统和呼吸系统功能障碍。目前，SCI的治疗方法主要包括大剂量甲泼尼龙冲击、脊髓松解减压和手术固定以及康复训练等，这些方法虽然被广泛应用于SCI临床
随着现代交通的发展，脊髓损伤(SCI)已经成为常见的外伤性疾病，可导致中枢神经系统感觉运动功能障碍且不可逆，造成截瘫或四肢瘫，从而严重影响患者的日常生活和生存质量。其并发症的发生也会是致命的威胁并大大加重患者的家庭负担，例如膀胱和直肠功能障碍、心血管系统和呼吸系统功能障碍。
目前，SCI的治疗方法主要包括大剂量甲泼尼龙冲击、脊髓松解减压和手术固定以及康复训练等，这些方法虽然被广泛应用于SCI临床治疗，但是至今仍然无法治愈SCI患者。生物细胞干预是目前SCI治疗的热点，移植的细胞类型主要有：神经干细胞(NSCs)、施万细胞(SCs)、间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)、嗅鞘细胞(OECs)、活化的巨噬细胞，以及诱导的多能干细胞(IPSCs)。在这些细胞中，SCs有其独特的优势：SCs对外周神经系统损伤后促进轴突再生起着重要的作用，因此也用于修复中枢神经系统损伤。现结合对SCs移植治疗SCI的研究现状进行综述。
SCs的获取
SCs的来源及取材：
SCs是胶质细胞的一种，多数起源于神经嵴，然后发展成为前体细胞，接着转变成不成熟细胞，最后分化成有髓鞘SCs和无髓鞘SCs。SCs分化成熟后一般包绕在外周神经的轴突周围，也有部分存在于神经根中，但中枢神经系统中没有SCs，中枢神经与外周神经存在交界区，SCs常规并不能穿越该交界区进入中枢神经系统。目前研究所用SCs取材主要来源于实验动物的坐骨神经、腋神经、背侧根神经等外周神经，也有取自人类自身的外周神经，为了研究需要而研制成细胞系。由于SCs在胚胎期和新生期的活性和再生能力明显高于成年，因此原代细胞培养多选取胚胎或新生期动物。
SCs的分离提纯及培养：
20世纪70年代，有研究发现SCs可以从组织培养中分离并提纯，用于中枢神经损伤的修复，但在SCs提纯过程中，由于其与成纤维细胞较难分离，导致SCs被成纤维细胞污染的几率较大，获得大量的高纯度的SCs较难。细胞提纯及培养技术在20世纪末得到不断发展，使获得的细胞纯度越来越高，细胞数量越来越多，目前主要采用分离的组织块培养与酶消化相结合的方法，以尽可能去除神经膜中包含的成纤维细胞。另外还有其它的一些培养方法，例如差速分离法、层粘连蛋白吸附法、低浓度酶浓液培养法等，均可获得大量的纯度较高的SCs。宋振宇等采用将Wistar大鼠坐骨神经暴露于Forskolin2周预变性处理，使用2g/ml多聚赖氨酸作为细胞外基质培养，最后用EGTA试剂进行提纯的方法分离获得活性好和高浓度、高纯度的SCs，为临床研究奠定了基础。
SCs对SCI修复的机制
SCI后的病理生理变化：
首先为机械应力损伤，SCI后，随之发生级联反应，例如破坏局部离子平衡、谷氨酸的释放、脂质过氧化物生成，甚至导致局部急性缺血。进而发生细胞水平的复合损伤：宿主免疫系统应答损伤导致大量细胞死亡，接着出现细胞坏死和凋亡、氧自由基及过氧化物的损伤、神经兴奋性中毒以及轴索的损伤。损伤后星形胶质细胞增生，聚集而连接在一起，随后一些小胶质细胞、巨细胞、分化的祖细胞等也积累聚集在一起形成胶质瘢痕。因此，阻止凋亡或代替损伤细胞，使受损的轴突再髓鞘化、抑制瘢痕形成便是细胞治疗的目的。
SCs修复神经损伤的过程：
在外周神经损伤后，SCs会迅速地分割损伤后的神经或合并那些被破坏的髓鞘，并且诱聚和激活巨噬细胞吞噬髓鞘碎片。末梢神经的SCs则能够去分化形成无髓鞘SCs并大量增殖，随后迁移到新生的结缔组织中，形成一个被称为Bungner带的类柱状的结构，为轴突的生长形成结构基础。由于其优势属性，在移植到损伤脊髓时，SCs先去分化，随后大量增殖，吞噬局部的坏死组织和瘢痕组织，从而减少空洞形成，并保护损伤局部周围的组织，同时SCs分泌神经营养因子，改善抑制脊髓再生的微环境，为轴突的延长创造有利条件。这个过程伴有髓鞘相关抑制轴突再生的分子表达下调和细胞黏附分子的上调，其中细胞黏附分子有：神经细胞黏附分子(NCAM)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、L1等，这些黏附分子与轴突生长锥表面相关的分子相结合，促进SCs再次分泌层粘连蛋白、纤粘连蛋白等与生长锥表面相关受体结合，引起生长锥内结构的改变，从而使轴突延长。SCs能够诱导轴突生长并形成髓鞘包绕延长的轴突，这对中枢神经系统损伤后的修复是至关重要的，更重要的是能够建立郎飞结与轴突的离子通道而重新维持动作电位的传导。
Cs在修复过程中可分泌神经营养因子：
SCs在修复损伤的过程中会分泌一些神经营养因子，这些神经营养因子能够促进并维持神经细胞的生长和分化，为SCs的修复过程提供一个有利的环境。这些神经营养因子主要有：神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT3)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。每个神经营养因子在修复的过程中发挥着特有作用，例如NGF作用于感觉和交感神经，促进神经细胞存活以及感觉神经的再生；NT3和BDNF分别作用于皮质脊髓束和红核及运动神经元；GDNF不仅能够促进运动神经元的存活和生长，还能增加少突胶质细胞的数量，延迟胶质瘢痕的形成，更有利于新生的轴突髓鞘化。
一般情况下，脊髓和外周的组织是被神经胶质界膜(GLM)隔离开的。在SCI后，神经胶质界膜短时间内被破坏，位于外周背根神经的SCs自发地进入脊髓进行修复，但SCI后局部形成的微环境以及胶质瘢痕抑制了SCs的存活，这就为SCs移植治疗SCI提供了思路而且提出了更高的要求。
SCs在SCI实验中的相关研究
来自外周神经系统的SCs已证实可被分离、提纯，并且大量扩增，可用来修复中枢神经系统损伤。大量的研究表明，SCs移植治疗SCI能够提供神经保护的效果，促进轴突生长以及再髓鞘化。另有研究表明，SCs移植能够促进SCI后感觉神经功能的修复。但是也有研究发现如果没有额外的干预，脊髓神经轴突很难长入移植的SCs中，不能穿过移植的SCs进入脊髓组织。而且SCI后形成的低氧环境、活性氧物质、细胞诱导的免疫反应等也不利于移植的SCs存活。另外，由星形胶质细胞、小胶质细胞等组成的胶质瘢痕，无论是物理结构还是化学成分都会抑制轴突的生长。因此，SCs移植治疗SCI要克服这些问题，需要联合策略来增加移植的SCs的存活率，并最大限度地发挥SCs促进中枢神经系统轴突再生作用。所以，目前的研究主要集中在一些联合的治疗策略方面。
SCs联合其它细胞移植治疗SCI
(1)干细胞移植：干细胞属于一类原始细胞，有非常高的分化潜能，通过自我更新、增值、分化成不同类型的功能性细胞，例如NSCs、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。Niapour等通过联合胚胎干细胞和SCs移植到大鼠SCI部位后发现两者具有协同作用，SCs能够促进胚胎细胞向神经元分化并促进功能恢复。张睿等也发现SCs能够促进NSCs分化成神经元的比例大于分化成胶质细胞的比例，相对于单纯SCs移植有着明显的优势。
(2)SCs联合OECs移植：OECs起源于胚胎神经上皮组织，在成年时期从嗅上皮到嗅球持续地更新。OECs不仅有SCs的特性，同时还具备星形胶质细胞的特性，能够分泌NGF、NT4/5、NT-3以及BDNF等，促进受损轴突再生，形成髓鞘并穿过胶质瘢痕。Pearse等通过联合OECs移植SCI后1周的大鼠模型，最终发现显着地提高了轴突的再生，并且通过BBB评分评估大鼠的后肢运动功能有所改善，说明OECs联合SCs移植治疗SCI在一定程度上有修复运动功能的可能。
(3)SCs联合少突胶质细胞移植：少突胶质细胞是中枢神经系统中的一种髓鞘形成细胞，SCI后少突胶质细胞的死亡会导致轴突脱髓鞘，可作为基础细胞治疗SCI。Xie等利用过表达髓鞘基因调控因子(MRF)的少突胶质细胞前体细胞联合SCs移植，结果发现在有丝分裂后中枢神经系统中的少突胶质细胞特异性地表达MRF，作为一个转录调控因子，能够促进少突胶质细胞的成熟和中枢神经系统的髓鞘形成，大鼠SCI后6周相比于单纯移植组BBB评分明显增高，运动功能有一定的改善。
基因工程技术修饰的SCs移植：
单纯SCs移植受到移植环境的影响，不能稳定地生长，而通过基因工程技术改造的SCs，其移植存活率提高，细胞活性和分泌能力也得以增强。Zhang等利用人端粒酶反转录基因(hTERT)转染SCs修复SCI，将反转录病毒PLXSN作为hTERT转染的SCs的介导载体注射到大鼠SCI的部位，使细胞凋亡、水通道蛋白4/9以及基质金属蛋白酶9/2的基因表达的数量有所下降，并且增加了PKH26荧光染色的阳性细胞的数量和运动、感觉诱发电位的振幅，注射后1～4周发现转染组相比于非转染SCs组的大鼠下肢功能明显得到改善。Sahenk等用AdNT-3转染SCs，发现NT-3刺激轴突生长可以和SCs促进再生的特性相结合，更有利于促进轴突的再生。所以，基因工程技术修饰的SCs在SCI修复中能发挥更大的优势，为今后的研究奠定了基础。
SCs联合组织工程支架移植：
由各种组织工程材料制作的支架能够接近生理环境，降低排斥反应，有利于细胞的增殖、分化。可分为天然材料支架和合成材料支架，两种材料均可降解，但合成的支架能够按照要求人为可控。崔学文等用纤维蛋白胶支架搭载外胚间充质源SCs移植修复大鼠SCI，结果发现细胞-支架移植在损伤部位未见大量胶质增生和空洞形成，NF-200阳性纤维和GAP-43阳性纤维在断端形成有利于新生神经纤维穿行的网状结构，使SCs能够在良好的环境下生长、增值、分化，大鼠伤后8周肢运动功能评分明显增高，说明纤维蛋白可做支架联合SCs移植能够取得更好的修复效果。Xia等将PLGA支架结合SCs和NSCs的复合体应用于大鼠SCI模型中，发现相比于单纯细胞和支架移植，复合移植中的SCs能够更好地促进NSCs向神经元分化，促进运动功能的恢复。目前，大多数的研究有良好的效果，这给将来SCI的研究带来更积极的作用。
SCs移植治疗SCI的临床应用
20世纪90年代就有许多基础研究已经证实SCs移植能够对脊髓有修复作用，在一定程度上能够促进运动感觉功能的恢复。也有不少研究使用各种物种的SCI模型进行SCs移植，但不能充分证明其移植的安全性。另外有一些应用于人类SCI的SCs移植的研究，证明了其安全性和可行性，说明在临床上用SCs移植治疗SCI患者有一定的潜能。
但目前SCs移植的临床应用还处于一个初期试验节段，Saberi等在前期的临床试验中有4例腓神经经纯化的SCs，在受伤后30～38个月自体移植到SCI部位，移植后1年以ASIA(ASIA)评分和MRI对肛门括约肌和性功能进行评估，所有患者在注射后均有短暂的感觉异常及肌肉痉挛，而MRI及病理检查没有明显的变化，其中1例不完全性损伤的患者的感觉运动功能表现出良好的改善，说明自身SCs对不完全性SCI显示出一定的疗效，但对完全损伤患者没有产生良好的效果。
3年后，Saberi等在后续的临床试验中报告了伊朗33例自身移植SCs进行胸SCI修复，2年的随访期显示自身SCs移植后的安全性并且部分患者有一定程度的感觉运动功能的恢复，此项试验意义重大，然而并没有在FDA严格地监督下进行，尚不能作为临床证据。最新的研究表明，自体腓肠神经移植治疗脊髓损伤的I期临床试验，6例移植后1年，没有细胞治疗相关不良事件。所以说，自身的SCs移植不用考虑减小移植排斥的免疫抑制反应，在大体上看来是安全的，但是还需要大样本前瞻性研究评估其远期的安全性，并做进一步的长期随访研究。
结语及展望
目前的研究提供了新的治疗策略，以防止继发性损伤、创造适宜的移植环境、促进再生、置换破坏的脊髓组织等，并且SCs提纯培养技术的快速发展，开启了自体移植的新机会，减少了宿主排斥，解决了一系列伦理问题，这使得SCs移植治疗SCI有很大的应用前景。虽然先前的实验和临床研究使我们更好地理解SCI后复杂的病理生理变化，但目前为止，基础医学研究、临床前研究以及临床研究都没有真正意义上地克服阻碍损伤脊髓复苏的各种因素，并且关于SCs移植的临床试验很少，不能获得临床相关的可靠数据。因此，我们还需要更深入地工作，获得SCs移植后的分布和移植后的作用机制更完整的理解，并且继续探索新的可行的治疗方法，评估安全性和疗效，应用转化医学思维模式，以期能够为SCI修复获得更大的。
作者：伊文
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