中国肝癌图谱，登上Nature!

中国肝细胞癌（HCC）的基因组分析在之前主要集中于外显子，并且受到样本规模的限制，从而无法在全基因组水平上进行详细的研究。然而，最近的全基因组癌症分析联盟（PCAWG）对癌症基因组复杂性进行了大规模分析，但相对浅层次的测序深度无法完全解析HCC基因组的亚克隆结构。因此，为了填补这一空白，海军军医大学王红阳院士/陈磊研究员课题组、北京大学生物医学前沿创新中心/北京未来基因诊断高精尖创新中心白凡教授课题组、杜克-新加坡国立大学医学院Steven G. Rozen教授课题组及福建和瑞基因吴琳博士团队合作，开展了中国肝细胞癌图谱（CLCA）项目，并对494例HCC肿瘤进行了深度全基因组测序（平均深度为120×）。他们发现了6个编码和28个未描述的非编码驱动基因候选者。他们还发现了五个以前未描述的突变特征，包括与马兜铃酸相关的插入缺失和双峰碱基特征，以及一个称为SBS_H8的单碱基替换特征。五核苷酸上下文分析和实验验证证实，SBS_H8与马兜铃酸相关的SBS22是不同的。值得注意的是，HBV整合可以采取外显圆形DNA的形式，导致基因拷贝数和基因表达升高。他们的高深度数据还使他们能够表征亚克隆簇聚的改变，包括染色体断裂、染色体交换和疱状基因，表明这些灾难性事件也可能发生在肝细胞癌发生的后期阶段。对所有类别的变化的通路分析进一步将非编码突变与肝脏代谢失调联系起来。最后，研究者进行了体外和体内实验，表明纤维蛋白原α链（FGA）作为编码和非编码驱动基因的候选者，调节了HCC的进展和转移。这项CLCA研究描绘了中国个体HCC的详细基因组景观和进化历史，提供了重要的临床意义。该研究成果以“Deep whole-genome analysis of 494 hepatocellular carcinomas”为题，于2024年2月14日发表在Nature上。论文共同第一研究者是海军军医大学陈磊研究员，北京大学生物医学前沿创新中心博士后张冲，北京大学-云南白药国际医学研究中心/北京大学第一医院肿瘤转化研究中心薛瑞栋研究员，杜克-新加坡国立大学医学院刘陌博士，南京大学医学院模式动物研究所博士研究生包金霞，以及福建和瑞基因白健博士、王寅博士。

【候选编码和非编码驱动基因的鉴定以及它们的克隆性】

研究中发现了23个候选编码驱动基因，包括TP53、CTNNB1和ALB等。与其他队列相比，CLCA发现了六个以前未描述的候选编码驱动基因，其中包括FGA、HNF1A、PRDM11、CDKN1B、BMP5和ECHS1等。此外，研究还鉴定了31个候选非编码驱动基因，其中包括六个启动子、八个长链非编码RNA（lncRNA）、四个lncRNA启动子、五个5'未翻译区（UTR）和八个3' UTR。值得注意的是，FGA（编码纤维蛋白原α链）被确定为候选编码和非编码（3' UTR）驱动基因。此外，研究还发现了十个候选驱动基因显示出显著的克隆性富集。其中，TP53和ALB两个编码驱动基因富集于克隆突变，而62.5%（8个中的5个）的非编码驱动基因富集于亚克隆突变，包括ZNF595、KCNJ12和OR2A7的启动子以及Z95704.4的lncRNA和lncRNA启动子等。最后，研究结果表明，所有克隆和亚克隆编码驱动基因的突变非同义/同义位点（dN/dS）比率均高于1，确认这些驱动基因受到了阳性选择的影响。

图1 | 候选驱动基因景观。

【SBS_H8：一种新型的基因突变印记的发现和分析】

在研究中，发现了17个单碱基替换（SBS）、3个双碱基替换（DBS）和8个小插入缺失（ID）的基因突变印记。与之前的 COSMICv3.2 相比，有五个印记是新的，包括一个单碱基替换印记 SBS_H8、两个双碱基替换印记 DBS_H1 和 DBS_H2，以及两个插入缺失印记 ID_H3 和 ID_H8。SBS_H8 的突变主要包括 T>[A/C]，具有显著的转录链偏向。虽然 SBS_H8 中的 T>A 突变模式类似于与阿魏酸相关的 COSMIC SBS22，但 SBS_H8 也包含了相当比例的 T>C 突变，两者的余弦相似度为 0.71。而 SBS_H8 的五核苷酸上下文余弦相似度为 0.61，进一步证明了 SBS_H8 是一种新的基因突变印记。值得注意的是，SBS_H8 在 CLCA 中的发现率为 57.1%，支持了这种前所未描述的 HCC 印记在中国人中的普遍存在。与 SBS_H2 的高共现率表明，SBS_H8 的病因因素可能常常与阿魏酸同时存在。另外，DBS_H2 和 ID_H3 这两种与阿魏酸相关的新型突变印记，以及它们的特征和关联性也被介绍。随后，通过对两种癌细胞系进行亚致死浓度的阿魏酸处理，确认了SBS_H2、DBS_H2 和 ID_H3 可以被阿魏酸引起。这些发现补充了关于阿魏酸突变谱的认识，并揭示了阿魏酸突变的多样路径。此外，对 SBS_H8 的分析结果表明它与阿魏酸暴露无关。最后，通过基于突变印记的无监督层次聚类对 494 个肿瘤进行分类，进一步证实了 SBS_H8 在 HCC 的发生中的重要性。

图2 | 以前未描述的突变印记。

【HBV在ecDNA中的整合】

深度全基因组测序数据使得对基因组重排的全面分析成为可能，包括拷贝数变异（CNAs）、结构变异（SVs）、HBV整合、染色体外环状DNA（ecDNA）以及三种形式的聚集性变异——kataegis、染色体破碎和染色体连接。在CLCA肿瘤中检测到27.3％的ecDNA（图3a），显著高于报道的PCAWG-HCC。在ecDNA中检测到了76个癌基因，包括HCC驱动基因MYC（图3b）。与不在ecDNA中的相对应的基因相比，ecDNA中的癌基因拷贝数更高，基因表达水平也更高。ecDNA的存在与不良预后相关（图3c）。值得注意的是，在七名患者中鉴定到了包含HBV片段的ecDNA（HBV-ecDNA），影响到已知的癌基因，如TERT（图3d–f）。ecDNA中的HBV片段显示出升高的拷贝数，以及增加的表达水平。尽管已经在HCC中鉴定出HBV-TERT整合，但结果表明，这些整合可以利用ecDNA的环状结构，因此可以扩增到数百个拷贝。ecDNA的存在已经成功验证（图3g）。总的来说，这些结果表明，基于ecDNA的扩增22可能在HBV相关HCC中起着重要作用。

图3 | ecDNA分析。

【亚克隆的灾难性事件】

聚集性突变过程，包括染色体破碎、染色体连接和kataegis等，这些基因组改变通常是在单个灾难性事件中产生的。传统观点认为这些变化是克隆事件，并支持了肿瘤的断续演化理论。然而，对于这些聚集性变化是否可能是亚克隆事件，并且在肿瘤演化的后期发生，了解较少。研究者利用高深度的CLCA全基因组测序数据进行了对这些事件的克隆状态的研究。

结果显示，约30.2%的病例中观察到了染色体破碎现象，与PCAWG-HCC的结果相当。其中，61%的高置信度事件涉及多个染色体，而22%仅涉及单一染色体。染色体连接在10.1%的CLCA病例中观察到，其中8.3%的病例只含有一个事件，而1.8%含有多个事件。总共，在33.6%的CLCA病例中识别出了364个kataegis事件，其中14.6%的病例具有多个kataegis事件。研究者还观察到了kataegis事件和拷贝数状态的振荡，表明局部的高突变可能与区域性结构变异和染色体破碎相关。46个（占13%）kataegis事件发生在32个（占6.5%）病例中是亚克隆事件，与PCAWG-HCC的研究结果不同，其中所有kataegis事件均为克隆事件，这表明kataegis可能是亚克隆事件，并且发生在肝细胞癌发生的后期阶段。进一步的推理分析显示，染色体破碎、染色体连接和kataegis事件的大部分都是克隆事件，但是广泛的几率比分布表明这些事件可能发生在肿瘤发生过程中的各个时期。

图4 | 基因组重排。

【肝细胞癌（HCC）中普遍存在的非编码驱动基因】

首先，研究者使用高深度的全基因组测序数据重建了中国CLCA中HCC的进化历史，并发现44.98%的点突变被分类为亚克隆的，远高于PCAWG-HCC的8%。与候选编码驱动基因相比，候选非编码驱动基因更多地富集在亚克隆类别中，暗示了候选非编码驱动基因在亚克隆分化中的更大贡献。进一步的信号通路分析显示，与编码突变相比，非编码突变在RTK-RAS-MAPK（22.1% vs 6.5%）、端粒维持（34% vs 1.4%）和肝代谢（23.1% vs 18.2%）等途径中的贡献更高。在肝代谢途径中，共涉及了15个潜在的驱动基因，这些变化影响了各种代谢程序，包括肝代谢、氧化应激、尿素代谢、酒精代谢、脂肪酸代谢和低氧。此外，对候选非编码驱动基因PPP1R12B和KCNJ12进行功能实验，结果显示，PPP1R12B低表达显著增强了肿瘤的迁移、侵袭、自我更新和细胞增殖能力，而KCNJ12破坏明显影响了肿瘤的迁移、侵袭、自我更新和细胞增殖能力。这些实验结果验证了PPP1R12B和KCNJ12是HCC的非编码驱动基因。

【FGA功能障碍促进HCC】

FGA在CLCA中被确定为候选编码和非编码驱动基因。研究发现，FGA的改变，包括点突变、等位基因丧失和拷贝数减少，都可能导致其表达水平降低。与正常组织相比，肿瘤中FGA的mRNA和蛋白水平均较低。进一步的实验发现，FGA点突变导致mRNA和蛋白表达降低，同时增强了肿瘤的进展。体内实验显示，针对FGA的shFGA细胞的皮下注射导致小鼠出现更大更具侵袭性的肿瘤。研究还发现，磷酸化酪氨酸激酶2（pTYK2）及其下游信号转导因子和STAT3的靶蛋白被识别为FGA的顶级下游信号。此外，研究表明，FGA功能障碍可能通过激活TYK2-STAT3-IL6回路来促进肝细胞癌的发生，这可能成为肝细胞癌干预和临床治疗的潜在靶点。

图5 | FGA功能障碍促进肝细胞癌进展。

【小结】

通过高深度的全基因组测序数据，我们能够识别出以前未描述过的潜在非编码驱动因子、突变印记和亚克隆灾难性事件，以及非编码事件在HCC进化过程中的普遍贡献。研究结果指出，中国HCC患者的肿瘤存在着与非中国患者不同的基因组变化和过程，这些发现揭示了中国HCC患者肿瘤中丰富的基因组变化和过程。另一方面，许多潜在的驱动事件，包括候选驱动基因、突变过程和聚类改变，与我们的CLCA队列、PCAWG-HCC队列和TCGA-HCC队列共享，表明HCC发病的通用过程。我们在CLCA队列中鉴定的28个非编码驱动因子以前未在HCC中报告过，这表明我们对HCC基因组的理解仍然非常有限。

尽管PCAWG项目已经表征了包括81个突变印记在内的人类癌症中的突变特征，但我们在CLCA队列中仍然能够鉴定出五个以前未描述的突变印记。这表明与日本和欧洲HCC患者队列相比，中国HCC患者具有独特的突变背景。虽然SBS_H8与与AA相关的SBS_H2不同，但CLCA中SBS_H8与SBS_H2的显著共同发生表明这两个突变特征的潜在病因因素可能经常共存。未来需要进行实验以确定SBS_H8的病因因素。

高深度数据使我们能够准确地确定了494个肿瘤的克隆组成，从而鉴定出一系列亚克隆事件。其中八个非编码驱动因子中有五个显示出亚克隆突变的显著富集。突变特征也表现出克隆偏好，为不同潜在病因因素的相对时间提供了重要线索。我们在亚克隆的kataegis、染色体破碎和染色质重排方面的发现表明，这些灾难性的基因组变化在HCC进化过程中可能以不同的时间发生，与报道的HCC中的克隆演化的结合性和逐渐性进化一致。此外，多个非编码驱动因子被映射到CLCA肿瘤的演化史中，而PCAWG报告只有一个非编码驱动因子。我们的结果为HCC的高分辨率演化史重建了基础。

HBV整合在中国患者肝癌中的HBV阳性肿瘤中已有广泛报道，热点位点已在TERT和KMT2B中确定。然而，这些整合体在基因组中的定位方式尚未全面评估。在这里，我们展示了这些HBV整合体可以作为ecDNA环状化。ecDNA的扩增导致了与配对线性DNA相比更高水平的癌基因转录，而且它们的特点是增强的染色质可及性。我们鉴定了HBV-癌基因-ecDNA结构，并观察到HBV及其靶向的癌基因的一致性增强的拷贝数和基因表达。这些结果揭示了HBV整合在HCC肿瘤发生中的一种机制。

我们报道了中国个体HCC的全面基因组景观，涵盖了多种类别的体细胞突变。这些不同的遗传变异如何与肿瘤微环境中多样的免疫和基质细胞类型相互作用，值得深入研究。总的来说，我们的CLCA研究是一个宝贵的资源，为HCC的癌症发生机制和临床诊断与治疗提供了重要的生物学洞见。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07054-3