北中医研究：多组学大揭秘，黄芪龙胆颗粒如何拯救缺血性脑卒中？

脑卒中（Stroke）是以猝然昏倒，不省人事，伴发口角歪斜、语言不利而出现半身不遂为主要症状的一类脑血液循环障碍性疾病，具有高发病率、高死亡率以及高复发率等特点。当前，针对脑卒中的现代医学治疗指南，涵盖医学溶栓、手术取栓及抗凝治疗等多种方法，但在治疗时间窗上均存在一定的局限性。

黄芪龙胆颗粒（HQLDG）作为一种在临床上广泛应用的中药方剂，对急性缺血性脑卒中的治疗具有显著效果。然而，其具体的作用机制尚未明确。

近日，一篇名为“Multi-omics approaches for the understanding of therapeutic mechanism for Huang-Qi-Long-Dan Granule against ischemic stroke”的论文探究了HQLDG对缺血性脑卒中的作用及其潜在机制。

图1 论文首页

HQLDG可保护小鼠免受缺血性脑卒中损伤

MCAO手术后24小时内，小鼠神经系统评分显著上升，梗死体积明显扩大。在实验组中，无论是接受50mg/kg−1或100mg/kg−1的HQLDG治疗，还是接受4mg/kg−1的EGb761治疗的小鼠，均显著降低了梗死体积（图2C-2D）及神经系统评分（图2B）。鉴于100mg/kg−1的HQLDG的疗效更为优异，研究者决定在后续的实验中持续采用该剂量。

为更深入地探究脑缺血的病理变化，研究采用了HE染色法进行观察。结果显示，tMCAO处理组细胞数量减少，形态不规则（具体表现为神经元细胞质浓缩，细胞核萎缩），且组织空间增加（图2A）。HQLDG治疗后，细胞的形态及排列均得到明显改善。

图2 HQLDG可保护小鼠免受缺血性脑卒中损伤

HQLDG改善了tMCAO作用下小鼠的肠道屏障损伤

鉴于HQLDG对肠道微生物群的调节作用，研究进而对肠道屏障的完整性进行了细致的评估。tMCAO处理组的结肠组织浆膜层呈现出明显的松动状态，单层柱状细胞亦受到损伤（图3A）。此外，tMCAO处理组的肠道结构中，炎症细胞的浸润现象显著。经HQLDG的治疗后，结肠的结构得到了显著的改善。

为了更深入地了解肠道屏障的状态，研究者进一步检测了肠道紧密连接基因的表达情况。tMCAO处理组中ZO-1、Occludin以及Claudin-1的表达水平均出现了明显的降低（图3B-D）。经过HQLDG的处理后，这些基因的表达量均得到了显著的提升。

图3 HQLDG保护肠道完整性免受缺血性脑卒中损伤

HQLDG下调了tMCAO小鼠的Th17/IL-17信号通路

热图聚类分析结果表明，HQLDG处理对多种基因的表达具有显著的调控作用（P<0.01，图4A）。这些受HQLDG调控的基因中，包含了47个上调基因和218个下调基因（P<0.05，图4B），且两组间存在显著差异。KEGG通路富集分析结果显示，HQLDG显著抑制了IL-17信号通路、Th17细胞分化等多种炎症相关通路的活性（图4C）。此外，GO富集分析结果进一步证实，HQLDG能有效调节多种免疫相关功能，包括但不限于自身免疫反应、抗原呈递过程以及免疫球蛋白与抗原的结合（图4D）。

图4 RNA测序分析，揭示HQLDG对缺血性脑卒中小鼠的影响

HQLDG保护肠道和脑屏障免受tMCAO损伤

研究采用FITC-葡聚糖和Evans blue（EB）作为工具，以评估肠屏障和脑血屏障（BBB）的完整性。结果显示，tMCAO处理后，血液中FITC-右旋糖酐的含量显著上升。相比之下，HQLDG处理则显著降低了血液中FITC-右旋糖酐的水平（图5A）。此外，tMCAO处理组在脑内EB的含量上也出现了显著升高，而HQLDG处理则显著降低了这一水平（图5B）。

此外，研究还采用ELISA试剂盒检测了血清中的IL-17A和IL-22。结果表明，tMCAO处理组血清中IL-17A和IL-22的浓度显著升高。而HQLDG处理则显著降低了这两种细胞因子的血清浓度。同时，HQLDG处理的小鼠中移植的粪便微生物群也显著降低了IL-17A和IL-22的血清浓度。然而，当抗生素与HQLDG共同使用时，其对血清中IL-17A和IL-22的抑制作用被削弱（图5C-D）。

综上所述，肠道微生物群在HQLDG对缺血性脑卒中的抑制作用中扮演着重要角色。

图5 HQLDG可调节肠漏、脑漏和血清炎症细胞因子

HQLDG通过调节肠道微生物-色氨酸代谢-AHr-Th17/IL-17通路，保护小鼠免受缺血性中风损伤

rorc的表达水平是作为Th17细胞活性的重要指示，芳基烃受体（Ahr）与色氨酸代谢物及IL-17的分泌过程存在紧密联系。

研究检测了Ahr、IL-17a、IL-22和rorc在肠组织和脑组织中的mRNA表达情况。结果表明，在tMCAO处理组中，肠组织和脑组织中Ahr、IL-17a、IL-22和rorc的表达水平均出现显著上升。而HQLDG处理则显著降低了这些因子的表达。然而，当抗生素与HQLDG联合处理时，Ahr、IL-17a、IL-22和rorc的表达水平又有所上升。尤其是，移植HQLDG处理小鼠的粪便微生物群后，也观察到Ahr、IL-17a、IL-22和rorc的表达水平显著下降（图6）。

这些发现提示，HQLDG可能通过调节肠道菌群来影响Ahr、IL-17a、IL-22和rorc的表达。先前的研究揭示，HQLDG具有调控色氨酸代谢途径的能力，而色氨酸衍生的微生物代谢物能够激活Ahr。鉴于Ahr在免疫调节中的重要作用，这些发现为进一步理解HQLDG的生物学效应提供了新的视角。

图6 HQLDG可调节肠组织和脑组织中Ahr、IL-17a、IL-22和rorc mRNA的表达

接下来，研究借助AhR抑制剂深入探究了Ahr与IL-17A之间的潜在联系。免疫荧光染色结果表明，tMCAO处理组的Ahr与IL-17A表达均呈现出显著的上调趋势（图7）。HQLDG处理组的Ahr与IL-17A表达均有所下调。此外，同时接受抗生素与HQLDG的联合处理时，Ahr与IL-17A的表达亦出现下调现象。最后，研究利用Ahr抑制剂CH-223191进行处理，进一步证实了HQLDG对Ahr与IL-17A表达具有显著下调作用。

图7 HQLDG可下调脑组织中Ahr和IL-17A的表达

结论

HQLDG通过肠道微生物-色氨酸代谢-Th17/IL-17信号通路，对缺血性脑卒中具有保护作用，可能为HQLDG在缺血性卒中预防领域提供全新的视角。但该研究仍存在一定的局限性，因此，对于HQLDG在缺血性脑卒中治疗中的具体作用机制，仍需进一步深入探索。

参考文献：

Wu C, Wu C, Peng L, Wu M, Li Z, Chen J. Multi-omics approaches for the understanding of therapeutic mechanism for Huang-Qi-Long-Dan Granule against ischemic stroke. Pharmacol Res. 2024 Jul;205:107229. doi: 10.1016/j.phrs.2024.107229