Oncogene:只会助眠褪黑素?它能增强奈拉替尼对乳腺癌的治疗效果!

2021-09-27 MedSci原创 MedSci原创

褪黑素通过促进HER2的内吞作用和溶酶体降解,增强Neratinib在HER2+乳腺癌中的细胞毒性作用

20%的乳腺癌中存在人表皮生长因子HER2/ERBB2的扩增/过表达。迄今为止,HER2阳性(HER2+)仍是抗HER2靶向疗法中唯一具有临床应用价值的生物标志物,科研人员已开发几种HER2靶向药物,包括单克隆抗体(曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)、小分子酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼和奈拉替尼)和抗体药物偶联物(T-DM1)。虽然HER2靶向药物极大地改善了HER2+乳腺癌的预后,但复发仍不可避免。通过结合不同种类的HER2靶向药物进行组合HER2阻断,已被证明比抗HER2单药治疗更好的抗肿瘤活性然而,如何提高现有治疗方法的疗效,确定更有效的组合策略,对治疗HER2+乳腺癌迫在眉睫。

奈拉替尼是新一代不可逆的、受体酪氨酸激酶(HER1/EGFR, HER2和HER4)小分子抑制剂,最近已被批准用于治疗HER2+乳腺癌。然而已有研究表明HER家族激酶的过度激活可能导致奈拉替尼耐药。因此迫切需要找到新的靶向治疗组合,通过消除HER2+或HER2突变乳腺癌中HER2的异常表达或激活来提高奈拉替尼的疗效。褪黑激素是人类和哺乳动物松果体分泌的一种天然激素。已有大量研究报道褪黑素通过不同作用机制表现出抗肿瘤特性。

本研究旨在阐明褪黑素单药及与奈拉替尼联合治疗HER2+乳腺癌细胞株的潜在效果。惊喜的是,本研究还揭示了褪黑激素在调节HER2蛋白质稳定性和增强内拉替尼在HER2乳腺癌中的细胞毒性作用的意外作用。

1、褪黑素治疗重现HER2靶向药物的作用

首先检测褪黑激素对三个HER2+乳腺癌细胞系存活率的影响。褪黑素治疗导致细胞死亡以时间和剂量依赖的方式显著增加(图1A)。为了解褪黑激素对HER2+乳腺癌细胞的细胞毒性作用,通过RNA测序对使用或不使用褪黑激素的HCC1954细胞进行转录组分析。基因集浓缩分析 (GSEA) 显示,褪黑激素治疗与包括EMT、KRAS、SRC、NF-κB和il6 - jax - stat3在内的基因集富集显著负相关(图1B, C),所有这些基因集与her2靶向治疗的疗效相关。 与这些结果一致的是,在HCC1954细胞中,褪黑激素处理导致磷酸化akt、磷酸化erk、磷酸化src信号和磷酸化nf -κB信号显著降低,EMT信号减弱(N-cadherin表达减少,E-cadherin表达增加)(图1D)。褪黑素治疗重现了HER2靶向药物引起的许多效应,促使我们调查褪黑激素是否会影响HER2本身的表达和/或活性。

2、褪黑激素降低HER2蛋白质的稳定性

用褪黑激素治疗的所有三个细胞系中,HER2蛋白质丰度都显著减少(图2A)。而褪黑激素治疗没有降低HER2 mRNA水平,这表明不能在转录水平解释褪黑激素引起的HER2蛋白水平降低。

通过蛋白质合成抑制剂环氧酰胺(CHX)检测褪黑激素对HER2+乳腺癌细胞中现有的HER2蛋白池的影响,HER2蛋白水平在CHX治疗后逐渐降低,而在褪黑激素治疗细胞中观察到HER2的更显著退化(图2B、D)。这表明褪黑激素治疗共同降低了HER2蛋白质的稳定性。

3、褪黑素治疗通过促进HER2的内吞作用和溶酶体降解来破坏HER2

已知受体稳定性受泛素-蛋白酶体和/或溶酶体机制调控。本研究发现MG132或Velcade抑制的蛋白酶体进一步降低了褪黑素处理后HER2蛋白的丰度(图3A, B)。相反,溶酶体抑制剂BAF恢复了降低的HER2水平(图3C),表明褪黑素可能主要通过内吞溶酶体降解诱导HER2下调。

检测褪黑素对HER2+乳腺癌细胞中HER2蛋白的细胞定位的影响试验显示,HER2蛋白在未处理的HCC1954细胞的细胞膜上强烈表达并在细胞质中扩散,而在褪黑激素处理的细胞中以胞内点的形式出现(图3D),提示褪黑素可能诱导HER2亚细胞运输。与此一致的是,流式细胞分析显示褪黑素以剂量依赖的方式显著减少了细胞表面HER2的数量(图3E)。这表明褪黑素在促进HER2内吞作用中的潜在作用。

褪黑素处理导致HSP90和HSC70表达降低,HSP70表达代偿性增加(图4A),同时,在褪黑素处理的细胞中HSP90与HER2共免疫沉淀的数量也显著减少,提示褪黑素可能诱导HSP90从HER2分离(图4B)。褪黑素治疗导致HER2泛素化水平升高(图4B)。免疫荧光染色分析显示,褪黑素治疗可使内化的HER2明显定位为点状结构(图4C)。此外,在褪黑素处理的HCC1954细胞中,HER2与LAMP1(晚期核内体/溶酶体标记物)共定位(图4D)。再加上溶酶体抑制剂BAF可挽救褪黑素诱导的HER2下调(图3C),这些数据都支持褪黑素通过促进内吞作用和溶酶体降解来破坏HER2的观点。

4、褪黑激素增强奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞中的细胞毒性作用

接下来将研究褪黑激素能否增强泛HER激酶抑制剂奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞的疗效。在所有测试的四种乳腺癌细胞系中观察到协同治疗反应后,通过克隆生存试验研究了药物联合的协同生长抑制作用与单药治疗相比,褪黑素和奈拉替尼联合使用诱导的生长抑制作用明显更强(图5A, B)。在对HER2+乳腺癌迁移潜能试验中发现,褪黑素+奈拉替尼组的划痕区域间间隙比单药组更大(图5C)。虽奈拉替尼和褪黑素各自在较小程度上降低了HER2蛋白丰度和磷酸化HER2信号,但联合治疗产生更强的抑制作用(图5D)。褪黑素或奈拉替尼单独产生中度细胞毒性作用,但联合治疗显著增加细胞死亡(图5E)。综上所述,这些数据表明褪黑素和奈拉替尼联合对HER2+乳腺癌细胞具有协同治疗活性。

5、褪黑素和奈拉替尼联合使用可有效阻断异种HCC1954肿瘤的生长

与对照组相比,褪黑素和奈拉替尼单药治疗显著降低HCC1954异种移植瘤的生长(图6A)。值得注意的是,与单独使用褪黑素和奈拉替尼相比,联合使用褪黑素和奈拉替尼对肿瘤生长的抑制更大(以平均肿瘤体积和终点肿瘤重量计算)(图6A-D),且只有联合治疗在一小部分肿瘤中实现了肿瘤逆转(5 / 8)(图6A, B)。与体外实验发现褪黑激素破坏HER2蛋白的结果一致,单独使用褪黑激素治疗的小鼠肿瘤显示HER2蛋白丰度显著降低(图6E)。我们还发现泛HER激酶抑制剂奈拉替尼降低了HER2蛋白丰度以及HER2信号通路(图6E和图5D)。此外,联合治疗在整个治疗过程中未产生明显的毒性作用。综上,联合使用褪黑激素和奈拉替尼或可提高对HER2 +乳腺癌治疗效果。

综上所述,本研究阐明了褪黑素和奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞中的联合治疗效果,证明了褪黑激素对HER2的破坏潜力。体外和体内实验结果都表明,褪黑素显著增强奈拉替尼对HER2阳性乳腺癌细胞的毒性作用,即使这些细胞含有PIK3CA突变而对HER2靶向药物反应较弱。未来研究将检验这个药物组合能否对her2靶向药物耐药的乳腺癌中发挥作用。

总的来说,该研究结果表明褪黑激素+奈拉替尼有望成为治疗HER2阳性乳腺癌的HER2双重阻断新策略。

 

原文来源:

Z. Liu et al.Melatonin potentiates the cytotoxic effect of Neratinib in HER2+ breast cancer through promoting endocytosis and lysosomal degradation of HER2.

Oncogene; https://doi.org/10.1038/s41388-021-02015-w

 

 



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