IVD新技术丨 DNA和RNA超快速检测方法
2024-01-28 小桔灯网 小桔灯网
本文报道了一种用于DNA和RNA的超快速BS-seq方法。使用优化配方,短时间高温处理即可提供了比传统BS条件低得多的背景,特别是在具有高GC含量或高度结构化的基因组区域,如mtDNA。
DNA中的5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine, 5mC)是一种基本的表观遗传标记,在调控基因表达、染色质组织和细胞身份中起着至关重要的作用。亚硫酸氢盐测序(BS-seq)是5mC定位的金标准,BS-seq依赖于单链DNA中每一个未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,因此双链DNA (dsDNA)的变性是至关重要的,以避免高背景或假阳性。另一方面,转化需要较长的反应时间和较高的温度,可能会造成严重的DNA损伤以及DNA降解。
除DNA外,5mC还存在于多种RNA物种中,包括rRNA、tRNA、mRNA和各种非编码RNA。虽然使用商用试剂盒的BS-seq可以很容易地应用于丰富的RNA(如tRNA和rRNA)中的m5C检测,但其中一些RNA物种的结构阻碍了准确定量。当传统的BS-seq应用于mRNA等低丰度RNA物种时,发现了比较大的差异。这些不一致的发现提出了开发更敏感和可靠的方法来识别和定量mRNA中真正的m5C位点的需求。
为了克服传统BS-seq在DNA和RNA中定位5-甲基胞嘧啶的局限性,杂志Nature biotechnology上发表了一篇题为“Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA”的文章。本文报道了一种用于DNA和RNA的超快速BS-seq (UBS-seq)方法。使用优化配方,短时间高温处理即可提供了比传统BS条件低得多的背景,特别是在具有高GC含量或高度结构化的基因组区域,如mtDNA。当应用于RNA m5C检测时,UBS-seq大大减少了背景及假阳性。作者在HeLa mRNA中发现了数千个m5C位点,其中约90%对NSUN2缺失敏感,证实UBS-seq产生非常低的假阳性率。
图片来源:Nature biotechnology
主要内容
当前BS-seq的局限性及基于BS反应机理的解决方案
假阳性和DNA/RNA损伤是目前BS-seq的两大局限性。从机制上讲,BS-seq中存在两种竞争途径,其中一种途径提供所需的C-to-U转化,而另一种途径导致DNA/RNA降解(图a)。作者推测如果使用浓度较高的BS试剂,可以加快BS的转化率,从而减少DNA的降解。此外,较高的温度不仅可以加速BS反应,而且还有助于使dsDNA或RNA中的二级结构变性,从而可以在更短的时间内完成亚硫酸氢盐的完全转化。同时还需要确保BS浓度的增加和反应温度的升高不会导致BS与5mC或m5C发生不良反应,降低5mC/m5C检测灵敏度。
BS-seq中C脱氨及降解机制。
图片来源:Nature biotechnology
UBS-seq能减少假阳性
作者筛选了一系列BS条件,并确定了一个BS配方(UBS-1)。使用UBS-1在98°C下孵育5-mer DNA寡核苷酸AGCGA,MALDI-TOF MS显示在3分钟内胞嘧啶完全转化为尿嘧啶- BS加合物(图b),UBS条件可以加速BS转化~13倍。5mC DNA寡核苷酸探针处理10分钟后没有观察到5mC的明显反应,这表明UBS条件在10分钟内不会产生假阴性(图c)。
4mC是细菌gDNA中另一种已知的胞嘧啶甲基化,传统的BS条件可介导~50%的4mC脱氨;因此使用传统的BS-seq检测5mC时产生假阳性。结果显示,UBS-1条件下,4mC被定量转化为dU(图e),4mC和C位点均被读取为T。在常规BS条件下,两个4mC位点以~1:1的比例被读取为C/T(图f),这表明UBS条件可以消除4mC引起的潜在假阳性。
UBS-seq可以减少假阳性。图片来源:Nature biotechnology
UBS-seq给出的背景比传统BS-seq低得多
作者进一步使用无5mC修饰的λ-DNA和有高度修饰CpG基序的pUC19质粒评估了UBS-seq的假阳性率。UBS-1或常规BS测序结果显示,UBS-1条件下处理10 min的C平均未转化率低至~0.06%,而传统BS处理在λ-DNA上的背景值高出13倍以上(图g)。对于更结构化的PUC19,在常规BS-seq中,非CpG位点的平均未转换率增加到2.3%,比UBS-1条件高出22倍以上(图i,j)。对于所有甲基化的CpG位点,两种方法均检测到>94%(图k)。这些结果说明了,UBS-seq中使用的更高温度(98°C)可以有效地使所有区域的dsDNA变性,以提供每个低且均匀分布的背景。
UBS-seq产生较低背景。图片来源:Nature biotechnology
使用mESC gDNA验证UBS-seq
作者使用小鼠胚胎干细胞(mESC) gDNA全面比较UBS-seq与传统BS-seq的性能。分析了加标λ-DNA中所有C位点的背景,发现UBS-seq给出的背景远低于传统BS-seq。对于CpG位点,两种方法得到的5mC分布模式相似,传统BS-seq显示的5mC水平略高。使用传统BS-seq检测到的位于非CpG基序的5mC位点的百分比高于UBS-seq,这表明使用传统BS-seq检测低甲基化化学计量核酸的5mC位点可能导致高假阳性率。总之,研究结果表明,UBS-seq在减少背景、减少5mC水平高估和更高的基因组覆盖率方面优于传统的BS-seq。
使用低输入量基因组DNA样本,UBS-seq优于BS-seq。
图片来源:Nature biotechnology
UBS-seq在low-input DNA样本和cfDNA中的应用
当使用传统的BS-seq时,在单个细胞到100个细胞水平上进行5mC mapping时,随着输入样本量的减少,观察到背景噪声的急剧增加(图a)。从λ-DNA的峰值估计,UBS-seq显示的背景比传统BS-seq低20倍。且mtDNA的背景值都远高于加标λ-DNA,这可能是由于mtDNA中存在高度结构化的区域。在常规BS-seq中,未转化位点的比例也达到90%(图b)。相比之下,UBS-seq的背景要低得多,进一步证明了其在减少假阳性方面的优势。
UBS-seq相对于传统BS-seq的优势,如更低的背景、更少的DNA降解和超快的处理时间,意味着UBS-seq可以作为cfDNA 5mC测序的有力工具。作者使用人血浆中分离的cfDNA进行平行文库构建。UBS-seq结果始终显示沿基因均匀分布,无论是在技术重复内还是在不同input中。然而,当使用传统的BS-seq时,在非CpG位点检测到的5mC化学计量学表现出更大的变异,进一步支持UBS-seq在使用cfDNA样品时的优越性能。
UBS-seq在1-100个mES细胞和cfDNA样品中的应用。
图片来源:Nature biotechnology
RNA m5C测序UBS配方的优化
RNA m5C BS-seq的一个主要障碍是平衡反应温度和RNA降解。作者发现了一种稍微不同的BS配方(UBS-2),可以在98°C下在3分钟内介导C到U-BS加合物的定量转化(图a),且m5C在处理后10分钟内未发生明显的亚硫酸盐反应,这表明UBS-2条件适合于RNA m5C检测。
使用人类28S rRNA进一步优化反应条件,因为它包含两个已确认的m5C位点。测序数据显示(图b),最佳条件为98℃孵育9 min,两个m5C位点检测到的平均分数>95%且没有检测到假阳性位点(图c)。相比之下,当使用EZ Zymo RNA甲基化试剂盒时,观察到非常高的背景,导致~18%的假阳性率。
RNA m5C测序UBS配方的优化。
图片来源:Nature biotechnology
UBS-seq在人mRNA中的应用
作者应用≥5%的未转化cutoff值,分别在HeLa和HEK293T细胞的polyA+ RNA中鉴定出2723和2404个m5C位点(图a,b),比以往报道更多的m5C位点,且与报道的有很好的重叠。m5c修饰类型在两种细胞系之间是相似的,约80%位于蛋白质编码区,其中一半以上位于编码序列区。
在HeLa细胞系中敲除了NSUN2,发现约90%的m5C位点的修饰分数大幅下降(图i),证实UBS-seq产生非常低的假阳性率。同样,CUCCA基序上的m5C位点也在NSUN6敲低的HeLa细胞中得到了验证(图j)。HeLa和HEK293T m5C位点均在转录本5 '端显示出相似的富集模式。结合核糖体分析数据,作者发现转录本5 '端的m5C修饰可能调节翻译效率。
UBS-seq在人mRNA中的应用。
图片来源:Nature biotechnology
总结与讨论
在高等真核生物中,基因DNA中的5mC是最丰富、最重要的表观遗传标记。BS-seq是检测DNA甲基化的金标准,广泛应用于基础研究和临床应用。作者通过使用铵盐代替亚硫酸氢钠盐来获得更高的亚硫酸氢盐浓度和更高的反应温度来加速反应并使DNA/RNA变性,从而在几分钟内完成BS转化,从而解决了BS-Seq的缺陷。UBS-1条件不仅提高了BS效率,显著降低背景,特别是在高度结构化的DNA区域,而且还减少了DNA降解,最大限度地减少了5mC水平的高估,还避免了由于某些gDNA中存在4mC而引起的潜在假阳性。
但UBS-seq仍然有两个缺点。一个是C到U转换导致的读取复杂性低,这可能会导致mapping问题。可以通过构建具有较长片段的库并使用pair-end测序来提高mapping。二是不能区分5mC和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。UBS-seq后得到5mC和5hmC的和。可以用APOBEC3A处理会使5mC脱胺,只留下5hmC可以被读取为C的位点。
作者:小桔灯网
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