打开抗癌新思路！Nature：ecDNA“抱团行动”促使癌基因表达扩增

一直以来大家都默认基因都是在染色体上，染色体外DNA（ecDNA）这一概念的出现可以说是颠覆了大家的传统认知，原来研究了半天，竟是搞错了方向，癌基因其实并不在我们关注的染色体上。由此，癌症研究打开了一扇新大门。

ecDNA是一种存在于染色体外，高度开放的DNA 颗粒，普遍存在于人类癌细胞中。因其能通过基因扩增和改变基因调控来介导癌基因的高表达，被认为与肿瘤的异质性和耐药性相关。 

编码致癌基因的ecDNA是癌症基因组的普遍特征，也是癌症进展的一个强有力的驱动因素。ecDNA是共价闭合双链，大小从100千碱基到几兆碱基不等。因缺乏着丝粒，ecDNA在细胞分裂过程中会随机分布于子细胞，这就方便了其快速积累，而且可以重新整合到染色体中，因此也可作为某些染色体扩增的前体。ecDNA具有更高的染色质可及性，但却缺乏更高的染色质致密性，且包含内源性致癌基因增强子元件，这表明癌基因扩增子可能是通过调控依赖性来扩增转录的。因其本身存在于染色体外，目前对其细胞核中的空间还不清楚。ecDNA在细胞分裂期间或DNA损伤后会相互聚集，但其聚集后生物学后果目前还不甚了解。 

11月24日，斯坦福大学HowardChang教授团队在《Nature》发表了题为“ecDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression” 的论文，他们研究了致癌ecDNA的细胞核空间、表观遗传因子和转录调控，发现聚集在间期细胞核中的ecDNA可以“抱团行动”，驱动分子间增强子信号来促使癌基因表达扩增。

https://doi.org/10.1038/s41586-021-04116-8

ecDNA促进癌症基因表达

研究团队通过DNA荧光原位杂交（FISH）来观察间期细胞核中的ecDNA的聚集点，包括前列腺癌细胞系PC3（MYC扩增）、结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYC扩增）、多形性成胶质细胞瘤细胞系HK359（EGFR扩增）和胃癌细胞系SNU16（MYC和FGFR2扩增）。结果显示，所有ecDNA阳性癌细胞中，除去有数十到数百个单独的ecDNA分子，ecDNAFISH基本都集中在间期细胞核中，这表明ecDNA彼此之间有强烈的聚集，研究团队将其称为ecDNA中心。进一步实验后发现，在具有不同癌基因扩增的各种癌症类型和原发性肿瘤中均存在ecDNA聚集。 

研究人员利用DNA和新生RNAFISH，在PC3和COLO320-DM细胞中观察到活跃转录的MYC等位基因，并计算出每个ecDNA分子的MYC转录概率。大多数新生MYCmRNA转录本来自ecDNA中心，而不是来自染色体。此外，与单子ecDNA相比，ecDNA中心的转录活性更高。因此，ecDNAs中心聚集时，每个ecDNA分子更有可能转录致癌基因。

ecDNA聚集转录成像

BRD4连接ecDNA中心和转录 

癌基因MYC包含MYC和浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1，拷贝数扩增相关的lncRNA，已知的癌症相关区域），两侧是由组蛋白H3乙酰化赖氨酸27（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4）为标记的超级增强因子。为了检查活细胞中的MYCecDNA，研究人员在COLO320-DM细胞的MYCecDNA中插入了Tet-operator（TetO）阵列，并用Tet-eGFP标记了ecDNA，以尽量减少GFP二聚化。活细胞成像显示，有多个动态核病灶对应ecDNA聚集。内源性BRD4的表位标记显示，BRD4在TetO标记的ecDNA中心高度富集。通过对H3K27ac和BRD4进行测序和染色质免疫沉淀来分析染色质，结果显示标记活性H3K27ac的ecDNA也被BRD4占据。 

为了确定BET蛋白在ecDNA相关转录中的作用，研究人员重点研究了同源的结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYCecDNA）和COLO320-HSR（来源于同一患者肿瘤）。TetO-GFPCOLO320-DM细胞中进行的活细胞成像显示，ecDNA中心在有丝分裂过程中被分解成更小的颗粒。分解后，ecDNAs又再次聚集成大中心。值得注意的是，有丝分裂后，ecDNA中心重新聚集被JQ1（BRD4抑制剂）阻断。结果表明，在COLO320-DM细胞中，ecDNA中心的形成、维持和肿瘤基因转录对BET蛋白H3K27ac相互作用有独特的依赖性。

BET蛋白介导ecDNA中心的形成和转录

ecDNA中心反式激活

为了将ecDNA结构与MYC转录调控联系起来，研究团队使用五种正交方法重建了COLO320-DM的ecDNA，报告了目前已知的组装的最大的ecDNA结构，包含PVT1-MYC融合、标准MYC序列和来自多个染色体起源的序列（6、8、13和16号染色体）的多个拷贝，并且利用DNA FISH验证了PLUT、PCAT1和MYC基因在重建预测的ecDNA上的共定位。

研究团队在COLO320-DM细胞中观察到了PVT1启动子处的强BRD4结合，但在COLO320-DMecDNA细胞中未观察到。因PVT1启动子能被MYC激活，研究团队又假设PVT1-MYC融合可实现MYC表达的正反馈，避免PVT1和MYC启动子之间的过度表达，但在几种人类癌症中观察到了PVT1重排和基因融合并驱动基因过度表达。

接下来，研究人员确定了与癌基因高表达相关的ecDNA调控元件。72049个来自COLO320-DM和COLO320-HSR细胞的配对单细胞ATAC–seq和RNA-seq，经校正MYC拷贝数后确定了47个与高MYC表达相关的ecDNA调控元件，而目前驱动ecDNA上MYC癌基因表达的PVT1启动子（PVT1p）在ecDNA中心内接受了广泛的组合增强子输入。进一步实验表明，分子间增强子-启动子在ecDNA中心激活，同时研究人员证实PVT1p作为一种DNA元件，能够反式激活ecDNA中心。

ecDNA中心外体荧光素酶报告的分子间激活

ecDNA间的分子调控

研究人员进一步研究了分子间增强子-基因相互作用是如何进行精确定位和干扰。以人胃癌细胞系SNU16为研究对象，其包含8号和11号染色体的MYC扩增子和10号染色体的成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）扩增子。H3K27ac的染色质免疫沉淀和测序显示FGFR2和MYCecDNA之间存在分子间接触，并富集了焦点相互作用。CRISPR干扰（CRISPRi）靶向候选调控元件确定了与MYC或FGFR2在顺式和反式表达相关的功能元件。 

实验结果表明，FGFR2和MYCecDNA已被共同选择，因此这两个扩增子上的增强子可协同激活MYC表达。MYC蛋白继而激活FGFR2表达。顺式和反式调控元件之间几乎没有重叠，表明分子间增强子元件是直接修饰反式基因表达，而非通过下游效应。癌症类型中的分子间ecDNA的相互作用评估显示，ecDNA中心的分子间增强子-基因激活发生在不同的肿瘤基因位点和多种癌症类型。

ecDNA中心介导分子间增强子-基因的相互作用 

综上所述，上述研究显示ecDNA“抱团行动”促进了新的分子间增强子-基因相互作用和癌基因过表达，且可以发生在不同的肿瘤基因位点和多种癌症类型中。与传统的顺式染色体转录不同，ecDNA中心反式调控能够实现分子间转录调控，这对如何实现更好的癌基因转录具有重要的启示作用。未来的研究可能会发现在各种癌症类型中介导ecDNA转录活性的蛋白质，并可将其作为潜在的治疗靶点，癌症研究也将进一步进阶到新领域。

参考资料：

[1]WU S, TURNER KM, NGUYEN N, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and highoncogene expression[J]. Nature, 2019, 575(7784): 699-703.DOI:10.1038/s41586-019-1763-5.

[2]TURNER K M,DESHPANDE V, BEYTER D, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drivestumour evolution and genetic heterogeneity[J]. Nature, 2017, 543(7643):122-125. DOI:10.1038/ nature21356.

[3]ecDNA hubsdrive cooperative intermolecular oncogene expression.