云南大学附属医院（红会医院）内分泌科杨莹主任团队研究并揭示了糖尿病足患者肠道真菌失调现象及潜在诊疗靶点

2型糖尿病（T2DM）是全球公认的重大健康问题，中国20-79岁糖尿病患者达1.409亿人，发病率为12.8%，占全球糖尿病患者总数的26.26%。预计到2045年，中国糖尿病患者将达到1.744亿，成为中国第一大原发性慢性疾病。糖尿病足（DF）作为一种严重的长期并发症，可导致组织死亡或截肢。据估计，全世界每20秒就有一名糖尿病患者因DF而截肢，死亡率高达22%。因此，预防是治疗DF的首要手段，提高早期筛查成功率可以规范后续治疗，并显著改善预后。对于肠道真菌发展的研究提高了疾病的早期筛查成功率，而肠道真菌在云南2型糖尿病和糖尿病足患者中的组成和差异以及潜在作用有待进一步确认。

2024年9月3日，云南大学附属医院（红会医院）内分泌科杨莹主任团队在Nutrition & Diabetes发表了一篇题为“Diabetic foot exacerbates gut mycobiome dysbiosis in adult patients with type 2 diabetes mellitus: revealing diagnostic markers”的原创研究性文章，该文章从临床样本出发，结合真菌测序及分析研究并揭示了云南2型糖尿病和糖尿病足患者肠道真菌的组成和差异，并提出了有望成为新型诊疗靶点的肠道真菌，并指出了其目前的缺陷和所面临的挑战，以及真菌相关研究未来发展的前景。

所有符合条件的患者均确诊为T2DM或T2DM- DF，受试者包括男性和女性，并设定了严格的纳入和排除标准。最终，我们分别选取了在内分泌科门诊确诊为T2DM的本地患者33例，确诊为T2DM- DF的本地患者32例；此外，我们选取了32名没有任何已知疾病的非肥胖健康当地个体作为健康对照（HC）。并收集了他们的粪便和血液样本以用作后续的实验研究。

与HC相比，T2DM和T2DM-DF的Chao指数和ACE指数均显著下降，但T2DM-DF的下降更为明显；T2DM的Simpson指数和Shannon指数与T2DM-DF相比也发生了显著变化；且T2DM-DF与HC之间存在显著差异（图1a）。而从Venn图的重叠则可以更好地理解群体之间共享的丰富度，在1596个OTUs中只有135个在所有组中被发现（图1b），且T2DM和T2DM- DF患者的OTUs明显低于HC。β-多样性分析结果表明，不同类群间真菌群落组成差异显著（图1c、1d）。这些数据表明，T2DM和T2DM- DF显著降低了真菌群落的丰富度和多样性，而T2DM- DF与T2DM相比也存在差异。

图1  T2DM和T2DM_DF改变了肠道真菌的丰富度和多样性

HC、T2DM和T2DM- DF的肠道真菌谱显示了两个显著改变的门，子囊菌门和担子菌门，占真菌群落的99%（图2a）。在HC中，子囊菌门是优势门，其次是担子菌门（图2a）。在T2DM-DF中子囊菌的丰度明显高于HC和T2DM（图2b）；而担子菌的丰度明显低于HC和T2DM（图2c）。有趣的是，与HC相比，T2DM和T2DM- DF的子囊菌/担子菌比例显著改变，T2DM- DF与T2DM相比，子囊菌/担子菌比例增加显著（图2d）。也就是说，T2DM-DF的肠道真菌在门水平上发生了更大的变化。

在排名前30的科中，与HC相比，T2DM中有6个科发生了显著变化，而T2DM-DF中则有17个科发生了显著变化（图2e）。值得注意的是，Schizophyllaceae（裂褶菌科）在T2DM-DF的肠道中完全消失（图2e）。为了进一步确定变化，我们同时在科水平上比较了T2DM和T2DM-DF的肠道真菌，发现与T2DM相比，T2DM-DF有7个科变化显著，其中，Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis单独显著增加，而Psathyrellaceae单独显著减少（图2e）。

在排名前30的属中，与HC相比，T2DM共有5个属发生显著变化，T2DM-DF有15个属发生显著变化（图2f）。值得注意的是，HC的肠道中没有Cutaneotrichosporon，但在T2DM和T2DM-DF中则明显增加（图2f）。另外，与科水平表达一致的是，Schizophyllum在T2DM-DF的肠道中完全消失（图2f）。接下来，在属水平上比较了T2DM和T2DM-DF的肠道真菌，发现与T2DM相比，有8个属的T2DM-DF发生了显著变化，在这其中，Candida单独显著增加，而unclassified_f__Dipodascaceae单独显著减少（图2f）。因此，这两种真菌有望成为诊断T2DM-DF的生物标志物，并为T2DM-DF的临床诊断提供参考。

最后，在排名前15的种中，三组中所有种的相对丰度均存在显著差异。与HC相比，T2DM有3种增加，12种减少；T2DM-DF有5种增加，10种减少（图2g）。我们发现，与HC相比，某些真菌种类在T2DM和T2DM- DF中表现出不同的增减趋势。与T2DM相比，T2DM- DF中只有1个菌种最显著增加，即unclassified_g_Candida，这与属水平的变化相一致（图2g）。

此外，再次利用LDA和LEfSe对HC、T2DM、T2DM-DF组真菌群落组成进行分析（图3a，b），三组之间的菌种组成存在显著差异，也与之前的分析结果相互印证。

图2  T2DM和T2DM_DF患者肠道真菌组成

图3  T2DM和T2DM-DF患者的真菌生物标志物

PICRUSt被用于预测真菌在T2DM和T2DM-DF患者中的功能，并利用KEGG数据库确定了与功能类别相关的酶。与HC相比，只有一种酶在T2DM中有显著变化，即非特异性单加氧酶（unspecific monooxygenase）。与HC和T2DM相比，该酶在T2DM-DF中也显著降低。此外，T2DM-DF组有3种酶明显改变：DNA定向RNA聚合酶（DNA-directed RNA polymerase）和葡聚糖1,4 - α -葡萄糖苷酶（glucan 1, 4-alpha-glucosidase）明显低于HC组；组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase）明显低于HC组或T2DM组（图4）。综上所述，T2DM-DF组的肠道真菌功能变化显著于T2DM组。

图4  T2DM和T2DM-DF患者中的酶功能分析

基于各组肠道真菌种类的组成差异和功能分析，为了更准确地识别特征真菌，我们使用随机森林模型对每组中所有真菌的重要性进行前15排位。结果表明，与HC相比，T2DM和T2DM-DF中最重要的15种真菌中有4种相同，则11种真菌可作为区分T2DM或T2DM-DF与健康个体的生物标志物（图5b，c）,这一结果也与LEfSe分析相互印证。接下来，则对比了T2DM和T2DM-DF之间的差异真菌种类，在前15种真菌中，有8种真菌可以作为区分T2DM中DF的生物标志物（图5d）。这些分析结果为通过真菌检测技术预测T2DM患者DF的发展提供了基础，并有可能使DF的早期治疗成为可能。最后，为了进一步确定三组中具有特征的重要真菌物种，我们又对三组间进行了组合分析（图5a）。ROC曲线也展示了以上结果的较好预测准确性（图5e-g）。

图5 T2DM和T2DM-DF患者特征菌种重要性排序

热图相关性分析显示，前15种真菌中有8种与肥胖指数、肝功能和血液参数具有显著相关性（图6）。其中5种真菌仅与一个因素显著相关；此外，3种真菌与各种可能导致T2DM和T2DM-DF发病的因素显著相关。值得注意的是，Naganishia_sp可能会起到缓解T2DM和T2DM-DF的作用；而unclassified_g_Candida则可能诱导或促进T2DM和T2DM-DF的发展。

图6 通过Spearman相关分析预测肥胖指数、肝功能、血液参数与前15种真菌之间的关系

本研究利用真菌测序探讨了T2DM、T2DM-DF患者和健康人群之间肠道真菌的差异，发现了一些可能被确定为的肠道真菌标记物和诊断靶点。为肠道真菌预测T2DM和T2DM-DF的发展提供了可能，也填补了云南省本地T2DM、T2DM-DF患者肠道真菌组成研究的空缺。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41387-024-00328-9