震撼！身痛逐瘀汤竟成神经性痛大鼠的“疼痛克星”！

神经性疼痛（NP）是慢性疼痛中最为严重的一种类型，其根源在于影响躯体感觉系统的疾病或损伤。除了具有痛觉过敏、异位痛和自发性疼痛等典型症状外，NP还可能对患者的生理、心理以及社会健康产生多方面的负面影响，因此，对于NP的早期关注和治疗显得尤为重要。然而，当前针对NP的镇痛药物在治疗效果上有所局限，且往往伴随不良反应，这极大增加了NP的治疗难度。因此，我们迫切需要研发出一种更为有效的药物，以协助众多NP患者摆脱病痛的困扰。

中医理论中，NP的主要病因及病理机制可归结为气滞与血瘀的相互作用。身痛逐瘀汤（STZYD）作为一种传统的行气活血方剂，在临床实践中常用于腰腿痛的治疗，然而，其确切的作用机制仍需进一步的研究与明确。

近日，一篇名为“Study on analgesic effect of Shentong Zhuyu Decoction in neuropathic pain rats by network pharmacology and RNA-Seq”的文章利用网络药理学探究了该方剂的镇痛作用。

图1 论文首页

STZYD的镇痛作用

图2呈现了不同组别的行为测试结果。结果显示，从第三天起，（慢性压迫性损伤）CCI组大鼠出现显著的痛觉过敏现象，其机械缩足阈值（MWT）和热回收潜伏期（TWL）相较于Sham组明显降低（P<0.05），并在此后的15天内维持于较低水平。但第11天，H-STZYD组和M-STZYD组的MWT值显著高于CCI组（P<0.05），第15天，仅H-STZYD和M-STZYD两组的MWT值维持显著高于CCI组（P<0.05）。

与MWT值的变化趋势不同，L-STZYD组在第3天至第15天期间，其TWL值均高于CCI组（P<0.05）。M-STZYD和H-STZYD两组在第7天至第15天期间，TWL值亦显著高于CCI组（P<0.05）。至第15天，H-SYZYD组的TWL值不仅显著高于CCI组，且与Sham组接近（P<0.05），显示出良好的治疗效果。

图2 STZYD对不同组CCI大鼠MWT结果行为性测试的影响（n=6）

STZYD的网络药理分析

该研究利用TCMSP和SwissTargetPrediction数据库，成功预测了与STZYD相关的1230个潜在靶标，并筛选识别出538个疾病目标。这些预测结果中共有173个重叠目标（图3A）。基于这些潜在活性化合物和交叉靶标的预测结果，研究构建了一个“成分-靶标-疾病”网络图（图3B），以深入探究其关联关系。

为进一步分析这些重叠靶标之间的相互作用，研究保存了173个重叠目标并构建了PPI网络。在设定最小交互阈值为“0.9”的条件下，得到了一个包含173个节点和485个边的网络图（图3D）。在此网络中，MAPK3、STAT3、MAPK1等靶标因其较高的度数而显得尤为突出。

为了深入了解这些重叠靶标的生物学功能，研究进行了GO富集分析。在生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）三个类别中，共选取了各自前10个显著富集的靶基因（图3C）。结果显示，STZYD可能影响疼痛的感觉知觉、细胞溶质钙离子浓度的调节、细胞钙离子稳态、膜电位调节、细胞二价无机阳离子稳态、突触传递等化学生物过程的调节，从而在NP的治疗中发挥潜在作用。

图3 网络药理学分析

STZYD诱导的CCI大鼠脊髓中的DEGs

经过对行为学结果的细致分析，研究观察到高剂量STZYD在镇痛效果上表现最为显著，因此，选用了H-STZYD的脊髓样本进行RNA-seq分析。结果显示，Sham组与CCI组之间的基因表达差异显著（图4A）。GO富集分析显示，前30项显著富集的功能类别涵盖了蛋白结合、树突、钙调素结合、黑质发育、对铅离子的反应以及少突胶质细胞祖细胞增殖的正调控等多个方面（图4B）。

此外，KEGG富集分析揭示，STZYD组的差异表达基因（DEGs）主要参与了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Ras信号通路、氨基丁酸能（GABAergic）突触以及逆行内源性大麻素信号通路（图4C）。这些结果为后续的研究提供了重要的参考依据。

图4 mRNA表达量的差异分析

为系统地鉴定STZYD组和CCI组中由DEG富集的通路，研究进行了IPA检测。结果显示，25个交互网络中，最高得分的网络（Score=52）揭示了31个与遗传性疾病、神经系统疾病、机体损伤和异常紧密关联的焦点分子（图5A）。此外，与疼痛相关的网络（Score=23），包含18个焦点分子（图5B）。STZYD治疗NP的经典通路为内源性大麻素神经元突触通路（−log (P)=4.89，比值=0.094）和背角神经元中的NP信号通路（−log (P)=1.99，比值=0.0693）（图5C、D）。

结果表明，STZYD的干预可能会对这些经典通路的信号传导产生影响，进而发挥其镇痛效果。同时，部分DEGs主要影响原发性NP、感觉障碍、痛觉过敏和神经传递的发展（图5C）。

图5 DEGs中典型通路、相互作用网络、疾病和功能分析的IPA检测

STZYD对CCI大鼠脊髓MAPK通路的影响

基于生物分析的数据，研究选定了特定的DEG进行验证。结果显示，有六个基因与RNA-seq结果相吻合，这六个基因分别是Cnr1、Cacng5、Gucy1a3、Kitlg、Npy2r和Grm8。进一步观察发现，相较于sham组，CCI组的Cnr1、Cacng5、Gucy1a3、Kitlg、Grm8、Npy2r基因表达均呈现显著上升趋势，然而，这一趋势被STZYD所逆转（图6A、F）。

图6 关于脊髓样本中的关键DEMs的qPCR和Western blot分析

经过对KEGG通路与IPA结果的深入分析，研究确认了在已验证的六个差异基因中，有五个与MAPK通路存在显著关联。因此，该研究主要聚焦于MAPK通路内分子的动态变化。结果显示，STZYD组中，MAPK通路的关键蛋白ERK1/2的表达水平呈现显著上升的趋势，与此同时，ERK1/2的磷酸化水平却明显降低（图7A、C）。STZYD处理后，ERK1/2下游的c-FOS表达量显著降低。尽管另一下游分子CREB的表达也有所下降，但此变化在统计学上并未达到显著差异。同样地，p-CREB在STZYD干预后的表达变化也未达到统计学上的显著差异（图7D、H）。为了更全面地了解这一过程，研究针对下游的炎症介质进行了qPCR检测，并发现STZYD中的nNOS和iNOS表达水平均显著降低（图7I、J）。

图7 关于MAPK通路的qPCR和Western blot分析

结论

总之，STZYD以其独特的促进气血循环之效能，展现了对CCI大鼠的显著镇痛作用。其镇痛作用可能依托于MAPK通路的调控机制，特别是涉及Cnr1等关键基因的表达。该研究不仅揭示了STZYD镇痛作用的潜在机制，更为中药处方的临床应用提供了坚实的理论依据。

参考文献：

Wang C, Lin J, Xie H, Chen L, Chen P, Wu L, Gong Q, Xia D, Wang X. Study on analgesic effect of Shentong Zhuyu Decoction in neuropathic pain rats by network pharmacology and RNA-Seq. J Ethnopharmacol. 2024 Aug 10;330:118189. doi: 10.1016/j.jep.2024.118189