Nature:巴钊庆博士等揭示抗体重链V基因重排的重要机制

今年肆虐全球的新型冠状病毒所引发的重大疫情不仅将研究者推向了开发疫苗和治疗性抗体的前沿，也在公众中再次科普了“疫苗”“抗体检测”“中和性抗体”等专业名词及其背后蕴含的基础免疫学知识。作为体液免疫的重要蛋白效应分子之一，抗体在人体识别和消除细菌、病毒等病原菌侵染过程中起着重要作用。

抗体作为分泌型的免疫球蛋白（Immunoglobulin， Ig），经B淋巴细胞生成，是由两组配对的重链（IgH）和轻链（IgL）经二硫键连接构成的Y型蛋白复合体。IgH和IgL分别具有可变区和恒定区，其中可变区特异性识别和结合抗原。可变区的编码基因由V(D)J重排（V(D)J recombination）反应产生。以IgH位点为例，在人和小鼠基因组中IgH位点跨越数百万碱基对（megabase， Mb），由数百个V、十多个D、多个J基因元件以及众多调控序列组成。在前体B淋巴细胞（progenitor B cell， 简称pro-B）发育过程中，V(D)J重排反应通过RAG内切酶催化断裂一个D基因和一个J 基因元件进而通过非同源重组末端连接（NHEJ）路径连接断裂元件从而形成DJH中间产物，接着再经过RAG 和NHEJ催化断裂和连接一个VH基因到DJH中间产物上，最终形成一段完整的IgH可变区编码基因VHDJH。V(D)J重排反应生成大量可变区编码基因库是构成抗体多样性的重要分子基础之一。

V(D)J重排反应中数量众多的V、D、J基因元件如何被RAG内切酶识别和切割从而参与生成非常多样化的可变区编码基因库是一个长期存在且引人入胜的核心问题。尽管很多研究从（表观）遗传学角度揭示了影响V(D)J重排的多种因素，但是这一重排过程具体是如何发生的并不清楚。

相对于人们一直推测的基于随机扩散的重排过程，近年来霍华德·休斯医学研究所(HHMI)、哈佛医学院（HMS）和波士顿儿童医院（BCH）的Frederick W. Alt院士实验室通过一系列工作表明V(D)J重排反应很有可能是通过RAG染色质扫描（RAG chromatin scanning）的线性化模型执行的。该实验室前期开创性地发现RAG具有线性化“追踪”（tracking）和切割基因组具有特定方向的off-target序列的活性，并且该活性范围与会聚型（convergent）CTCF结合元件（CTCF-binding element， CBE）形成的基因组环状结构域（loop domain）吻合。紧接着，该实验室通过研究一类位于小鼠IgH位点D近端VH基因下游紧邻的CBE的功能时进一步提出了可能基于染色质环挤出（loop extrusion）机制的RAG染色质扫描的线性化模型，该模型能够很好的解释近端VH-to-DJH的重排过程以及该过程中CBE的重要作用。该实验室随后发表的另一篇文章通过一系列实验表明该模型也很好解释了生理上的删除性D-to-JH重排问题，并进一步表明染色质环挤出在该重排过程中起到重要作用。然而，有关RAG染色质扫描的工作机制以及更重要的众多分隔于Mb以外的远端V基因是如何重排的等问题仍然不清楚。

2020年7月27日，来自霍华德·休斯医学研究所(HHMI)、哈佛医学院（HMS）和波士顿儿童医院（BCH）的Frederick W. Alt院士以及国立健康研究所（NIH）的Rafael Casellas教授团队在Nature杂志以Accelerated Article Preview形式在线发表了题为“CTCF orchestrates long-range cohesin-driven V(D)J recombinational scanning”的研究文章（巴钊庆博士为本文第一作者兼共同通讯作者，娄江曼博士为共同一作）。该文章揭示了粘黏蛋白cohesin介导的染色质环挤出驱动IgH位点线性迁移从而提供RAG扫描的底物，并且揭示了CTCF在该机制下调控远端VH重排中的重要作用，由此为该领域长期存在的一个核心问题提供了新的见解。

为了研究RAG染色质扫描的驱动力问题，研究者推测cohesin可能是一个重要因子。为了证明此观点，研究人员选用了小鼠永生化的v-Abl pro-B细胞系。该细胞系经诱导后能长期稳定生存于细胞周期的G1期，能大量激活RAG介导的D-to-JH重排、少量激活近端而几乎不能激活远端的VH-to-DJH重排。之前在该细胞系的研究证实了其发生的D-to-JH和近端VH-to-DJH正是通过RAG扫描介导的，那么在该细胞系中除去cohesin会怎样呢？研究者采用生长素诱导蛋白降解元（auxin-inducible degron， AID）策略在该细胞系里构建了cohesin复合物重要因子Rad21的AID降解体系（Rad21-degron），通过添加auxin快速降解Rad21。紧接着，研究者通过ChIP-seq证实了全基因组包括IgH位点cohesin的结合几乎全部消失，而IgH 位点转录活性以及已知的染色质互作及V(D)J重排必需基因的转录或表达均没有显着变化。研究者进而通过巴钊庆博士之前开发的3C-HTGTS发现相应的IgH位点上几乎所有的染色质环状结构域都消失了，这与之前在其它类型细胞中的发现一致，即cohesin对于染色质环挤出形成环状结构域是必需的。非常有意思的是，研究者进一步通过分析Rad21降解前后D-to-JH和近端VH-to-DJH的变化发现，Rad21降解几乎消除了所有近端VH-to-DJH重排，剧烈减少了几乎所有的D-to-JH重排，除了位于RAG高度富集的V(D)J重排中心（recombination center， RC）内部的DQ52元件的重排。之前的研究表明，DQ52由于其处于RC的位置特殊性，可以通过扩散接近RAG而发生重排，因此其重排并不完全依赖cohesin介导的环挤出过程。

为了更好地探究cohesin缺失的效应，研究在Rad21-degron系统里通过CRISPR/Cas9进一步敲除了IGCR1元件，之前发现IGCR1缺失后RAG扫描增强至IgH近端VH区域从而导致近端VH特别是VH81X基因的重排急剧升高，那么在此基础上缺失了cohesin会怎样呢？研究者发现Rad21降解依然几乎消除了所有增强了的近端VH-to-DJH重排，同时也剧烈减少了几乎所有的D-to-JH重排，再一次，只有DQ52重排仍然能够发生。相对应的，Rad21降解同时消除了IgH位点所有的染色质环状结构，包括由于IGCR1缺失而导致的极大增强了的RC与近端VH之间的环状相互作用。这些结果共同表明cohesin极有可能通过其介导的染色质环挤出介导了RAG扫描所执行的D-to-JH和近端VH-to-DJH重排过程。

除了近端VH基因，数百个远端VH基因是如何接近RAG而发生远距离重排呢？一直以来人们推测远端VH可能通过一种IgH固有的“位点紧缩”（physical locus contraction）过程进行重排。在该模型中，远端VH位点以某种未知机制接近并环绕RAG富集的重排中心从而使得每个VH基因以随机扩散的方式接近RAG而重排。由于缺乏明确的机制支撑，该模型一直处于假说阶段。本文研究者推测相对于该随机扩散模型，与D和近端VH基因重排类似，远端VH基因可能也是通过线性RAG染色质扫描过程得以接近RAG而完成重排。那么如何证明这一点呢？研究者采取了一个巧妙的策略。

研究者首先进行了大胆猜想：在VH区域，除了数百个VH基因外还存在着数量众多的CTCF结合元件CBEs；近端VH邻近CBE在RAG扫描过程中除了能够增强与其邻近的VH对于RAG的accessibility从而增强其重排能力，还额外阻滞了RAG进一步扫描其上游的其它近端VH进而减弱了其重排潜力；虽然众多远端VH基因之间的CBE的具体功能尚未可知，但这些CBE是否与近端CBE类似能够逐步阻滞RAG上游扫描过程，从而影响整个远端VH的重排潜能？进一步结合他们的发现，其表明与小鼠正常前体B细胞相比，其衍生出来的v-Abl细胞系只能进行少量的近端VH重排，而不能进行远端VH重排；相应的，该细胞系中IgH重排中心丢失了与远端VH位点的环状结构互作，而只存在少量与近端VH位点的互作。其原因一直未知，如果这是由于众多CBE对环挤出介导的RAG线性扫描的阻滞效应所导致的，那么抑制或去除所有这些CBE，是不是就能重新激活远端VH的重排？

为了验证这一点，研究者在v-Abl细胞系构建了CTCF-degron降解体系。添加auxin在整体水平上快速降解CTCF后，ChIP-seq证实CTCF 降解消除或极大下调了CTCF本身以及cohesin在基因组包括IgH上大部分CBE位点的结合；有意思的是，仍有一些CBE位点被未能完全降解而“残留的”CTCF蛋白结合，尤其是那些处于远端VH区域具有高度转录活性的位点。被诱导降解后CTCF在染色质水平上的非均一的结合变化可能反映了不同CBE位点自身的CTCF结合活性、局部染色质环境或其它未知因素。进一步的GRO-seq证实CTCF降解并未显着影响IgH重排中心和VH尤其远端VH转录，也未影响任何已知可能参与染色质相互作用和V(D)J重排的因子的转录，表明CTCF降解后的细胞仍然具有VH尤其远端VH重排的潜能。紧接着，研究者通过3C-HTGTS发现，非常有意思的是，CTCF降解强烈回复了v-Abl细胞系所丢失的RAG所在重排中心和几乎整个远端VH区域的染色质环状结构互作，并且与小鼠正常前体细胞内的互作高度类似，表明CTCF降解后IgH位点的染色质环挤出恢复作用到远端VH区域。那么相应的，远端VH是否也回复了重排能力呢？

答案是肯定的！研究者进一步检测了V(D)J重排变化，发现CTCF降解非常显着地、甚至有时极大地激活了绝大部分VH，包括远端VH的重排能力，并且与小鼠正常前体B细胞相比，虽然并不100%一致，CTCF降解后的v-Abl细胞系仍然表现出整体上非常类似的VH重排频率和模式。相应的，CTCF降解后的v-Abl细胞系在VHDJH和DJH重排的相对比率上显着增加并非常接近正常小鼠前体B细胞中的数值，表明VH重排在整体水平上也确实极大增强了。另外，研究者还通过分析RAG介导的off-target切割活性发现只有在CTCF降解后的细胞中RAG才高频切割了整个VH区域具有特定方向的off-target位点，进一步支持了CTCF敲除使得RAG扫描能够作用于整个VH区域从而介导远端VH重排的结论。

此外，研究者还进一步研究了CTCF-degron体系建立过程中产生的其它中间态的细胞系中远端VH重排与CTCF蛋白水平以及潜在活性之间的关系：发现CTCF C端插入介导降解的AID-GFP元件显着降低了CTCF蛋白水平，相应的远端VH开始发生重排；未经auxin处理的CTCF-degron体系存在leaky CTCF降解，使得CTCF蛋白水平进一步降低，相应的远端VH重排程度更高；进一步的auxin处理几乎降解了整体CTCF蛋白水平，相应的远端VH重排更加剧烈。这些结果表明远端VH重排对于CTCF蛋白水平以及潜在的活性的变化敏感，即后者的下调对于激活RAG扫描远端VH介导其重排具有重要的正向作用。最后，进一步通过综合各种组学数据进行更细致的分析，研究者认为在CTCF活性下调过程中VH的重排可能受到残留CTCF结合位点以及VH转录水平的影响，从而揭示了在进化上小鼠不同VH域可能采取了不同的策略保证各VH的重排潜能。

基于上述实验发现和分析，研究者最后提出了cohesin和CTCF参与的染色质环挤出介导的RAG扫描进行VH基因重排的模型，并认为在小鼠B细胞早期发育过程中存在直接调控CTCF/CBE阻滞物活性、或者通过调控cohesin等其它环挤出因子活性从而间接克服CTCF/CBE的阻滞效应从而允许cohesin介导的环挤出过程驱动RAG扫描整个VH区域而实现VH的重排。

总体而言，该研究大胆假设并设计和采取了巧妙的实验策略不仅确证了cohesin介导的环挤出过程在RAG扫描过程中的重要驱动作用，并且第一次揭示对单个CTCF蛋白水平的调控可以激活长距离VH重排过程。据我们了解得知，该工作在评审过程中受到多位审稿人的高度评价，审稿人不仅肯定了其在抗体可变区多样化机制问题上提供了“clear and sharp answer”，还肯定了其发现对于更普遍的基因组染色质结构及基因转录的调节同样具有重要的意义。审稿人直接写道：“These findings establish a new paradigm for the V-to-DJ recombination step of antigen receptor gene assembly. The findings also lead to a pleasing mechanistic simplification and unification， in that now， all recombination events taking place outside of the RC at Igh (and perhaps other loci) can be envisioned to be operating by a single fundamental scanning mechanism. This is destined to be a landmark study for the field.”

值得注意的是，比这篇文章稍早投稿并接收最近在Nature在线发表的另一篇研究文章揭示小鼠前体B细胞中cohesin染色质结合活性的负调控因子Wapl的转录水平与IgH位点长距离染色质相互作用以及VH重排负相关，并进一步发现Wapl转录水平下调的前体B细胞中cohesin在染色质上的停留时间增加（详见BioArt报道：Nature | 粘连蛋白释放因子Wapl促进V基因重排的机制）。之前在多种其它细胞中已证实Wapl水平下调能够整体上通过延长cohesin染色质停留时间从而克服会聚排列CBE元件对环挤出过程的阻滞效应从而延长染色质环状结构域。基于此，该文章认为小鼠前体B细胞通过在转录水平上调低Wapl从而促进IgH位点环挤出介导的VH基因重排。总结起来，这两篇文章从不同角度利用不同策略最终揭示了一个内在统一的抗体重链V基因重排的重要机制。

原始出处：

Zhaoqing Ba, Jiangman Lou, Adam Yongxin Ye,et al.CTCF orchestrates long-range cohesin-driven V(D)J recombinational scanning.Nature.Published: 27 July 2020