【综述】膜联蛋白A5在缺血性卒中诊疗中的研究进展

摘要:缺血性卒中是导致我国中老年人群残疾和死亡的重要病因之一,从诊断到治疗需要面临许多复杂的问题｡目前,血管再通治疗已成为缺血性卒中最重要的治疗方法｡但是,单纯行血管再通治疗后,部分患者的预后仍不理想｡此外,目前针对单一靶点的神经保护药物治疗缺血性卒中的效果仍不显著｡膜联蛋白A5具有多种生物学功能,其抗凝血､抗炎症､促进神经元存活等功能可用于减轻脑血管再通后再灌注损伤等神经保护治疗｡膜联蛋白A5因其与磷脂酰丝氨酸具有紧密结合特性,可用于卒中诊断､靶向治疗载体构建等｡作者总结膜联蛋白A5的多种功能,分析其在缺血性卒中中可能产生的影响,以期为后续研究提供参考｡

缺血性卒中是威胁全世界人类健康的主要问题之一,也是导致成人永久性残疾的主要病因之一｡在缺血性卒中发病早期,缺血-再灌注损伤可引起缺血区域炎症级联反应,导致不良预后｡尽管机械血栓切除术能有效提升卒中患者的血管再通率,但部分大动脉闭塞相关卒中患者术后仍有发生血管再闭塞的可能｡现有的针对单一靶点设计的神经保护药物的临床转化效果仍不理想,无法在整个复杂脑疾病网络中发挥有效作用｡Tiedt等总结相关研究后提出,最初以神经元为中心进行研究的观点已被神经血管单元(neurovascular unit, NVU)的概念所取代,神经元､胶质细胞､周细胞和微血管内皮细胞均在卒中病程中发挥作用,且各细胞存在信号交流｡研究者开始关注具有广泛活性的多靶点药物,其在治疗脑疾病中可能具有潜在的益处｡多靶点治疗缺血性卒中成为新的研究方向,其中抑制凝血､抑制炎症､神经保护是多靶点治疗急性缺血性卒中的关键要点｡

膜联蛋白A5(annexin Ⅴ,ANXA5)是膜联蛋白家族的一员,具有多种生物学功能及潜在应用价值｡笔者就ANXA5的多种功能对急性缺血性卒中可能产生的影响进行综述｡

1 ANXA5的结构特点

ANXA5是一种大小为36kDa的膜联蛋白,膜联蛋白家族是拥有核心结构域约70个氨基酸残基的保守序列,在钙存在的情况下具有结合带负电荷磷脂的能力;ANXA5与磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)的结合受蛋白质上的钙结合位点调节,结构域Ⅳ对钙与PS膜结合至关重要｡ANXA5的核心基团有3个不同的钙结合位点(Ⅱ型钙结合),该位点增强了ANXA5与PS结合的能力;Ⅲ型钙结合位点可以结合12个钙分子,增加了ANXA5对细胞膜的结合亲和力,并促进了ANXA5三聚体化,同时可将膜保持在液晶相｡ANXA5在钙存在下对PS的高结合亲和力使其成为具有辅助检测缺血性卒中潜力的新生物标志物｡

ANXA5具有稳定的构象,可在三聚体化形成后保持其凹形弯曲形状,有助于细胞内化;ANXA5三聚体可自组装成有序的二维晶格,增加表面张力,使质膜向内凹陷;ANXA5内化是非受体介导的,无需内部细胞信号传导,该机制提高了其内化的效率;内化后,含有ANXA5的内体与溶酶体融合,蛋白质被降解,因此过量的ANXA5可以被自身代谢,有助于提高后期ANXA5作为临床治疗药物时的安全性｡

2 ANXA5的抗血小板聚集､抗凝作用

阿司匹林作为抗血小板聚集药物,是预防缺血性卒中后卒中复发的有效药物之一｡但是,有研究显示,长期使用阿司匹林会增加消化道出血发生风险｡ANXA5作为人源性蛋白可能能够弥补传统药物的一些缺陷,提高其在使用过程中的安全性｡

在机体凝血时所发生的级联反应中,血小板的活化是极为重要的一步,此时血小板膜中PS会外翻暴露｡ANXA5作为细胞内蛋白,广泛存在于内皮细胞和血小板中,并在组织损伤时释放｡ANXA5能与PS结合,中断PS与其他促凝因子的反应,从而抑制凝血的发生｡另一方面,ANXA5也能与血小板表面的鞘糖脂———硫苷脂结合,通过阻碍硫苷脂活化凝血因子Ⅻ来抑制凝血的发生｡此外,ANXA5能抑制内皮细胞介导的凝血酶形成,起到抗凝血作用｡

Kuypers等使用重组DNA技术制备了ANXA5的同源二聚体(diannexin V, DAV),实验结果显示,DAV的半衰期可达6.5h｡为了验证DAV是否可以作为体内抗血栓剂,该研究通过注射组织因子和结扎下肢血管诱导大鼠血栓形成,在诱导血栓形成前10min注射不同浓度梯度DAV溶液,以检测最佳抗血栓剂量,结果显示,与注射等量等渗盐水比较,注射0.04mg/kg的DAV大鼠的平均血栓产生量降低(15mg/只比26mg/只,P<0.01),提示DAV具有抗血栓的作用;注射1mg/kg的DAV大鼠的平均血栓产生量较注射0.04､0.20mg/kg DAV均更小(分别为2､5､4mg/只,均P<0.05),提示1mg/kg剂量的DAV的抗栓效果最强,该研究结果表明,DAV可以作为高效抗血栓剂,并在1mg/kg时具有最大的抗栓效果｡Tait等报道了基于ANXA5靶向血小板血栓而制备的82kDa和69kDa两种嵌合体溶栓剂,通过对含碘放射性同位素的ANXA5(125I-ANXA5)的竞争性测定,确定嵌合体对暴露PS的细胞膜的亲和力,结果显示,在1 nmol/L的竞争性抑制剂存在的情况下,69kDa嵌合体､82kDa嵌合体､125I-ANXA5与暴露PS的细胞膜结合率分别为77%､83%和84%,差异无统计学意义(P>0.05),提示嵌合体与ANXA5的亲和力相近;用纤溶酶活化后,82kDa嵌合体的酰胺水解活性为(9.5±1.0)IU/pmol,69kDa嵌合体的酰胺水解活性为(4.9±1.6)IU/pmol,该数据与尿激酶的酰胺水解活性(9IU/pmol)相似,提示ANXA5作为血栓靶向成分,构建嵌合型溶栓剂具有可行性｡此外,Jing和Sun基于ANXA5和蛇毒来源的抗血小板肽,设计构建了一种新型的多机制融合蛋白,该融合蛋白表现出整合素调控和PS结合的双重特性,采用酶标仪测量不同血浆样品的浊度动力学,结果显示,将重组蛇毒锯鳞蝰素-ANXA5融合蛋白(restructure echistatin-ANXA5, r-EchAⅤ)添加至PS包被的孔中的血浆中时,与注射等量等渗盐水相比,20μmol/L的r-EchAⅤ可将凝血起始时间从30min延迟至50min;随着r-EchAⅤ浓度的增加,血浆凝固时间延长(浓度分别为0､5､10､20､30μmol/L时,血浆凝固时间分别可延长至30､35､40､50､65min),提示ANXA5构建的r-EchAⅤ在体内表现出良好的抗凝活性｡

3 ANXA5的抗炎症作用

炎症是缺血性卒中的重要病理生理｡脑缺血损伤和血流再灌注可导致炎症级联反应,进一步导致神经组织损伤和细胞死亡｡PS的外翻是介导细胞凋亡的重要信号,降低PS在脑缺血半暗带中的暴露,可能能够减少神经元凋亡,延缓缺血半暗带组织转变为梗死灶｡ANXA5能高亲和力结合PS,抑制巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,具有干扰凋亡细胞的免疫抑制作用｡

Gao等研究使用ANXA5抑制神经炎症,探索其在改善创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)中的作用,在TBI发生30min后,干预组经尾静脉注射重组人ANXA5(50μg/kg),结果显示,在Morris水迷宫实验中,TBI+ANXA5处理的小鼠在找到目标象限之前的移动距离短于TBI小鼠;在空间探寻实验中,TBI+ANXA5小鼠在目标象限中停留的时间更长,并且比TBI小鼠有更多的平台交叉互动时间(均P<0.05,鼠数为10只)｡为了证实ANXA5的神经保护作用,研究者采用改良神经系统严重程度评分和旋转棒实验评估了TBI后小鼠的神经功能和运动功能,结果显示,在所有时间点,假手术小鼠均未表现出明显的神经功能损害(改良神经系统严重程度评分1~3分),TBI+ANXA5组的改良神经系统严重程度评分均低于TBI组(均P<0.05,鼠数为10只)｡此外,从TBI后第1天至第5天,TBI+ANXA5小鼠在旋转棒实验中的运动表现优于TBI组小鼠(P<0.01),提示ANXA5可改善TBI后小鼠的神经损伤和运动功能;蛋白质印迹分析表明,与正常小鼠相比,TBI上调了小鼠受损皮质中炎症蛋白———高迁移率族蛋白B1的水平,而TBI+ANXA5组有效地降低了TBI小鼠中高迁移率族蛋白B1表达水平(均P<0.01,鼠数为6只);此外,蛋白质印迹分析结果显示,与TBI组相比,TBI+ANXA5组中抗炎因子血红素加氧酶1上调(P<0.01)｡上述研究结果提示ANXA5在TBI小鼠中发挥了神经保护作用,可通过调节高迁移率族蛋白B1信号通路和血红素加氧酶1抗氧化系统来改善神经炎症､氧化应激｡DeJong等使用表达人类突变载脂蛋白E的ApoE3-Leiden转基因小鼠作为高胆固醇鼠,高胆固醇诱导心肌炎症反应,引起心肌缺血-再灌注(myocardial ischemia - reperfusion, MI-R)损伤,为了探究模型小鼠MI-R损伤后ANXA5对左心室功能和重构的影响,治疗组对模型小鼠每天腹腔注射200μl浓度为1mg/kg的ANXA5,非治疗组模型鼠注射等量等渗盐水作为对照,分别在连续注射2d和3周时进行检测,结果显示,在MI-R损伤3周时,与非治疗组比较,ANXA5治疗组心肌梗死面积显著减小[(13.4±1.8)%比(18.3±1.1)%,P= 0.022],心脏舒张末期容积显著减少[(34.5 ± 2.2)μl比(44.4 ± 2.4)μl,P= 0.004],左心室射血分数增加了29%,左心室纤维含量减少了42%,同时梗死区域左心室壁的厚度增加了17%;在MI-R损伤后2d,与非治疗组小鼠相比,ANXA5治疗小鼠的心肌梗死区和交界区中增殖巨噬细胞的数量显著减少[梗死区:(73.8±17.0)个/mm2比(188.6±41.7)个/mm2,P=0.009;交界区:(69.3±8.6)个/mm2比(142.2±27.5)个/mm2,P= 0.008],白细胞介素6的产生降低[(1071±28)ng/L比(1455±65)ng/L,P< 0.01],该研究提示,ANXA5治疗可减弱缺血后炎症反应,改善左心室重塑,进而改善高胆固醇血症Apoe*3-Leiden小鼠MI-R损伤2d和3周后的心脏功能｡

目前尚未检索到ANXA5在缺血性卒中中抗炎症作用的具体研究｡通过调节缺血性卒中中ANXA5蛋白表达的水平,探究其是否可以抑制脑缺血损伤和血流再灌注过程中的炎症级联反应,进而保护缺血脑组织,将可能成为缺血性卒中神经保护相关研究的新方向｡

4 ANXA5在缺血性卒中诊断检测中的应用

缺血性卒中发生后,准确评估梗死灶位置､大小至关重要,目前临床多采用影像识别进行诊断｡Lee等研究了抗膜联蛋白Ⅴ抗体(anti - annexin Ⅴ antibody, aAⅤ)在急性缺血性卒中患者中的临床应用,共纳入187例急性脑梗死或短暂性脑缺血发作患者和66例健康者(对照组),采用酶联免疫吸附试验检测患者组和对照组的aAⅤ蛋白水平,结果显示,与对照组相比,患者组中aAⅤ阳性受试者的检出比例更高[13.9%(26/187)比4.5%(3/66),P=0.043];排除年龄的混杂因素后,患者组的aAⅤ阳性率仍高于对照组(P=0.018),表明急性缺血性卒中患者aAⅤ的检出率较高,提示ANXA5可能成为急性缺血性卒中的辅助诊断标志物｡

ANXA5可与多种标记信号分子耦联｡Mari等采用锝-99的核同质异能素锝-99m来标记ANXA5制成锝-99m-ANXA5,评估其能否无创监测局灶性大脑中动脉闭塞-再灌注损伤后大鼠的神经元损伤,制备16只成年雄性Sprague - Dawley大鼠的左侧大脑中动脉闭塞(2h)-再通模型,4只正常大鼠作为对照组｡每天经尾静脉注射锝-99m-ANXA5约185~370MBq(MBq:电离辐射的单位,用来衡量放射性活度,即单位时间内原子核的衰变数量),并在注射1h后开始对实验动物进行不同时间点的单光子发射计算机体层摄影(SPECT)和放射自显影检测,结果显示,大鼠大脑右半球和左半球在注射后4h的平均最大ANXA5摄取率分别比对照组高出(310±85)%和(365±151)%,均P<0.03,在第3天达到峰值[右半球(925±734)%,P<0.01;左半球(1194±643)%;P<0.01),在第7天开始下降[右半球(489±233)%,左半球(785±225)%,P<0.01]｡缺血损伤后4､24､72h左半球总梗死体积分别比右半球增加226%､261%､451%(均P<0.03);双荧光显微镜显示,ANXA5可定位于闭塞-再灌注损伤部位同侧受损神经元的细胞质以及对侧半球其他外观正常的神经元;该研究表明,大脑中动脉闭塞-再灌注损伤后,受损大脑组织区域对ANXA5的摄取量更高,提示ANXA5标志物可以监测局灶性大脑中动脉闭塞-再灌注损伤后神经元损伤｡Blankenberg等制备锝-99m肼烟酰胺标记的ANXA5(99mTc - HYNIC - ANXA5)确定其能否评估急性卒中患者的缺血性损伤以及局灶性缺血损伤动物模型中动物的治疗情况,2例急性缺血性卒中患者静脉注射1110MBq的示踪剂,1h后对患者进行SPECT,结果显示,患者的99mTc - HYNIC - ANXA5摄取区域与其MRI中大脑受损部位重合;动物实验中制备29只Sprague - Dawley大鼠的左侧大脑中动脉闭塞-再通模型,其中8只进行MFL4抗体(FasL细胞死亡因子的一种抗体,对缺血性卒中具有治疗作用)处理,21只大鼠注射等量等渗盐水作为对照组,再灌注1d和6d后根据大鼠体质量注射185 ~ 370MBq示踪剂,MRI和SPECT结果显示,与对照组相比,治疗组中99mTc - HYNIC - ANXA5的摄取率降低92%,并且第1天半胱天冬酶8染色神经元数量减少60%｡在第6天,与对照组相比,治疗组大鼠的99mTc - HYNIC - ANXA5摄取率减少了80%,梗死面积减少了75%｡对照组和治疗组大鼠的99mTc - HYNIC - ANXA5摄取率与梗死面积(r²=0.603,P=0.0036)及凋亡细胞数(r²=0.728, P=0.00084)呈线性相关｡该研究结果提示,ANXA5显像可用于辅助评价缺血性脑损伤治疗效果｡

5 ANXA5在缺血性卒中其他相关方向研究进展

5.1 基因

ANXA5的基因多态性对缺血性卒中具有一定影响｡ANXA5基因于1994年被详细探究,随后Tsakanova和Boiadzhian研究显示,缺血性卒中的发病与编码ANXA5蛋白的基因rs11575945存在关联,该研究纳入了94例缺血性卒中患者[35例男性和59例女性,平均年龄为(67±9)岁]和110名健康者[48名男性和62名女性,平均年龄为(57±9)岁],通过聚合酶链反应与等位基因特异性引物和免疫球分析进行测定,结果显示,患者ANXA5的等位基因rs11575945平均突变频率比健康人高2.6倍(P<0.01,OR=3.06,95%CI:1.85 ~ 5.06),血清中ANXA5平均浓度比健康受试者高3倍[(4.74±1.64)μg/L比(1.55 ± 0.53)μg/L,P<0.01];此外,ANXA5等位基因rs11575945-T的突变体携带者比rs11575945-C的正常纯合个体血清中ANXA5的浓度高4倍(P<0.01),该研究提示ANXA5基因的突变可能增加缺血性卒中发病风险｡

5.2 构建靶向载体

有研究者利用ANXA5与PS高亲和力的特性进行了靶向载体构建的创新性探究｡Quan等开发了一种基于ANXA5和血小板膜的新型组织型纤溶酶原激活剂递送平台(annexinⅤinserted  platelet fusogenic liposome - tissue plasminogen activator,APLT - PA),实验者对12只c57小鼠进行大脑中动脉闭塞后再灌注,随后分为4组,每组3只,APLT - PA治疗组注射0.5mg/kg的APLT - PA,其余3组分别注射等量等渗盐水､组织型纤溶酶原激活剂(tPA)､APLT作为对照组,结果显示,与注射等量等渗盐水､tPA､APLT处理组相比,注射APLT - PA组小鼠在给药后72h和7d时的梗死体积均显著降低(均P<0.01),血-脑屏障渗透率显著降低(均P<0.05),提示用ANXA5构建靶向载体来治疗缺血性卒中具有可行性｡该研究为缺血性卒中的精准溶栓治疗提供了一种新型､安全的仿生血小板纳米药物,并为细胞模拟纳米药物的多种生物医学应用的设计和开发提供了新的思路｡

5.3 神经保护

ANXA5可作为一种营养因子保护神经元｡Takei等使用胚胎大鼠原代皮质神经元进行神经元存活测定,在培养第1天和第3天将不同浓度重组ANXA5加入培养基中,实验结果显示,与不添加ANXA5组比较,相对较低剂量(1μg/L)ANXA5处理组中皮质神经元存活数量更多(细胞计数分别为230､160个/mm2);当给予浓度30μg/L的重组ANXA5时,神经元存活数量达到最大(细胞计数分别为400､160个/mm2);当向培养基中另加入10mg/L的ANXA5抗体时, ANXA5+抗体组细胞数量多于ANXA5组(分别为300､450个/mm2),提示ANXA5的神经营养活性被抑制,上述研究结果表明,人源重组ANXA5蛋白对体外培养的胚胎大鼠皮质神经元有促存活作用,对皮质神经元具有神经保护作用｡

6 总结与展望

在缺血性卒中的相关研究中,ANXA5作为具有多种生物学功能的内源性蛋白,具有辅助诊断､抗凝､抗炎症､参与靶向载体构建､促进神经元存活等多种功效,有望转化为一种对于缺血性卒中有效的多靶点治疗药物｡但其在人体上应用的实际功效仍需进一步的动物实验研究以及临床转化研究验证｡