Science：利用CRISPR/Cas9操纵染色体重组绘制遗传图

2016-05-07 佚名生物谷

当将表型性状绘制到基因组上特异性位点时，科学家们通常依赖于细胞减数分裂期间染色体的自然重组来推断对应的基因位置。但是重组事件在不同物种和染色体区域存在差异，这就使得人们不能控制基因组哪些区域发生交换。如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学洛杉矶分校的研究人员发现一种方法解决这种问题：利用CRISPR/Cas9技术在酵母细胞有丝分裂期间进行靶向重组事件。相关研究结果发表在2016年5月5日那期

当将表型性状绘制到基因组上特异性位点时，科学家们通常依赖于细胞减数分裂期间染色体的自然重组来推断对应的基因位置。但是重组事件在不同物种和染色体区域存在差异，这就使得人们不能控制基因组哪些区域发生交换。

如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学洛杉矶分校的研究人员发现一种方法解决这种问题：利用CRISPR/Cas9技术在酵母细胞有丝分裂期间进行靶向重组事件。相关研究结果发表在2016年5月5日那期Science期刊上，论文标题为“CRISPR-directed mitotic recombination enables genetic mapping without crosses”。

论文共同通信作者、加州大学洛杉矶分校科学家Leonid Kruglyak解释道，“当前的方法依赖于减数分裂期间自然发生的重组事件。不论这些事件的发生率是多少，你有些被迫接受。我们的想法就是利用CRISPR/Cas9，我们能够随心所欲地产生这些事件，在我们想要它们发生的确切地方发生、大量地发生，并且让我们轻松地挑选出它们发生的细胞。”

一般而言，研究人员利用感兴趣的性状与特异性的遗传标记物---这些标记物在基因组上的位置是已知的---的共遗传（coinheritance）来找出基因组中的哪一部分负责一种给定的表型。但是，这种方法经常需要非常大量的后代或很多代以便观察少量共遗传遭受破坏的个例。再者，绘制的遗传图分辨率受限于重组时交换的最短序列长度，而且这种序列可能包含几个基因或基因变异体。

Kruglyak说，“一旦你找到这个最小的基因组区域，那么你成功了。你需要选择其他的方法测试这个区域中的每个基因和每个变异体，而这充满挑战。”

但是，可编程的切割DNA的CRISPR/Cas9提供另外一种选择。在细胞有丝分裂---而不是减数分裂---期间，在准备分离的一条染色体臂上发生的罕见双链DNA断裂有时是通过一种被称作同源重组的机制修复的。这种机制利用同源配对的另一条染色体替换从发生断裂的位点到断裂的染色体臂的末端之间的序列。正常情形下，这种有丝分裂重组非常罕见，因此用来绘制遗传图是不现实的。然而，利用CRISPR/Cas9，研究人员发现他们能够在感兴趣的一条染色体（若是杂合子，则确保只有一条染色体发生切割）上的任何位点引入双链断裂，因而能够控制重组发生的位点。

将这种技术与位于同源配对的一条染色体顶端上的一种指示重组成功的信号基因（如绿色荧光蛋白, GFP）组合在一起，从而允许研究人员挑选出发生重组的细胞：如果重组失败的话，那么有丝分裂产生的两个子细胞将是杂合的，每个子细胞含有一个信号基因拷贝；但是如果重组成功的话，那么一个子细胞含有两个拷贝的信号基因，另一个子细胞不含有信号基因，这种结果被称作为杂合性丢失（loss of heterozygosity）。

论文共同通信作者、加州大学洛杉矶分校科学家Meru Sadhu解释道，“如果我们实现杂合性丢失. . .那么一半子细胞将不再拥有GFP基因。我们从总的细胞群体中寻找这些不含有GFP基因的细胞。”如果针对一种感兴趣的性状，这些因杂合性丢失不产生绿色荧光的细胞具有亲本细胞相同的表型，那么CRISPR/Cas9靶向重组丢失了导致这种表型的基因。然而，如果这种表型受到影响，那么这种性状一定与发生重组后是纯合的区域中的一个位点---位于切割位点和GFP基因之间的某个位置---相关联。

通过系统性地在杂合的酿酒酵母双倍体菌株中利用CRISPR/Cas9在染色体上进行切割，挑选出不产生绿色荧光的酵母细胞，然后观察它们的表型，研究人员证实它能够快速地鉴定出导致这种表型的特定基因变异体。

比如，研究人员证实锰敏感性---实验室酵母中的一种定义明确的表型性状能够利用这种方法精确定位到Pmr1蛋白（一种锰转运体）编码基因中的一个单核苷酸多态性（SNP）上。

美国加州大学圣地亚哥分校细胞与发育生物学家Ethan Bier（未参与这项研究）说，将这种技术应用于酵母之外的生物上将是非常重要的，这是因为染色体修复在不同生物之间存在差异。

Kruglyak认为，尽管在高等生物体内开展这样的研究虽有规划，但仍然处于初期阶段。如今，他的研究团队正在努力利用这种技术绘制导致不同酵母物种之间（而不是同一种酵母物种之内）性状差异的基因组位点

原始出处：

Meru J. Sadhu*, Joshua S. Bloom*, Laura Day, Leonid Kruglyak.CRISPR-directed mitotic recombination enables genetic mapping without crosses.Science 05 May 2016:DOI: 10.1126/science.aaf5124

作者：佚名

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