广中医一附院独步天下：网络药理与蛋白组学双重解密，小青龙汤竟成中性粒细胞性哮喘的守护神！

哮喘是一种广泛存在的慢性疾病，显著特征在于其反复发作的呼吸症状，包括但不限于气喘、呼吸急促、胸闷及咳嗽。依据诱导痰中的粒细胞水平，哮喘可被细分为四种不同的表型：嗜酸性粒细胞性哮喘、中性粒细胞性哮喘（NA）、混合粒细胞性哮喘以及少细胞性哮喘。当诱导痰中的中性粒细胞含量超过61%时，该哮喘被归类为NA。鉴于传统的治疗手段在应对NA时效果有限，当前迫切需求寻找更为有效的替代治疗方案。

小青龙汤（XQLD）具有辛温解表，解表散寒，温肺化饮之功效。主治外寒里饮证。作为临床上广泛应用的中草药配方，在治疗哮喘等过敏性疾病中表现出显著疗效。然而，对于其在治疗中性粒细胞性哮喘（NA）方面的具体内在机制，目前尚未有确切的科学解释。

日前，一篇名为“Integrative analysis of network pharmacology and proteomics reveal the protective effect of Xiaoqinglong Decotion on neutrophilic asthma”的文章探究了XQLD对NA的疗效和潜在机制。

图1 论文首页

XQLD改善NA小鼠气道炎症、粘液分泌和重塑

研究采用HE、PAS及Masson染色技术对肺组织进行了病理分析，以此来探讨XQLD对NA气道炎症、粘液分泌及气道重塑的具体影响。与对照组相比，NA小鼠在支气管与血管周边结缔组织中，存在显著的炎症细胞浸润现象。同时，NA小鼠的气道粘膜上皮结构遭受破坏且排列紊乱，伴有局灶性呼气异常，杯状细胞明显增生，并伴随有粘液产生。此外，NA组小鼠的气道和血管平滑肌细胞增殖现象亦更为显著。

与NA组相比，经XQLD不同剂量处理后，小鼠的炎症浸润及气道重塑现象均得到显著缓解（P＜0.05）。尤其是高剂量XQLD能有效减轻气道粘液分泌（P＜0.05）。然而，地塞米松在上述病理改善方面并未表现出显著效果（P＞0.05）（图2B–D，2G-I）。

为确保安全性，研究进一步通过HE染色技术评估了XQLD对小鼠肝脏和肾脏组织的潜在毒性。结果显示，各实验组小鼠的肝肾组织均未出现明显的炎症损伤或其他病理变化（P＞0.05）（图2E-F，2J-K）。

图2 NA小鼠模型的构建以及肺、肝、肾组织的组织学分析

XQLD抑制中性粒细胞浸润和中性粒细胞炎症相关细胞因子和IgE表达

研究确定了NA小鼠肺部炎症的主要成因是中性粒细胞的浸润（图3）。应用XQLD进行处理后，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及白细胞总数的显著减少。在过敏性疾病中，IgE的重要性已被广泛认可，而在暴露于OVA/CFA后，血清IgE水平出现上升（图3G）。

此外，与中性粒细胞炎症紧密相关的炎性细胞因子，例如IL-8和MPO，在NA组小鼠的血清或BALF中也有所增加（图3H-J）。值得注意的是，XQLD能够不同程度地降低上述炎性细胞因子（包括IgE、IL-8和MPO）的水平（P＜0.05）。然而，地塞米松在缓解上述炎性细胞因子增加方面并未表现出显著效果（P＞0.05）（图3G-J）。进一步观察NA小鼠的肺组织，免疫荧光染色揭示了NE和MPO分布的增加，而XQLD的应用则显著降低了这两种关键的中性粒细胞衍生蛋白的表达水平（图4A-B）。

图3 XQLD抑制中性粒细胞哮喘小鼠中性粒细胞炎症

XQLD降低PPI网络中鉴定的中枢基因的表达

经网络药理学分析，研究利用PPI分析成功识别出数个关键基因。体内实验中，研究系统检测了CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1以及FABP4的mRNA表达情况，这些基因在中性粒细胞性气道炎症进程中占据举足轻重的地位。如预期的那样，与NA组相比，经过不同剂量的XQLD处理后，上述基因的mRNA表达均呈现显著的抑制趋势（P＜0.05）。同时，研究发现地塞米松对CXCL10、CX3CR1和TLR7的mRNA表达无显著影响（P＞0.05）（图4C–G）。但地塞米松能够抑制FABP4和NCF1的mRNA表达。

图4 XQLD可抑制关键靶点NE和MPO的表达

蛋白质组学分析揭示XQLD治疗NA的机制

研究采用了|foldchange|≥1.2且p值<0.05的严格筛选标准对对照组、模型组以及XQLD组之间的DEPs（差异表达蛋白）进行了鉴定。图5A–C中的热图以及图5D–F中的火山图分别展示了模型组与对照组、XQLD组与模型组以及XQLD组与对照组之间的DEPs分布情况。数据表明，相较于对照组，模型组中有638个DEPs显著上调，440个DEPs显著下调；而XQLD组中则有737个DEPs显著上调，491个DEPs显著下调（图5G）。此外，与模型组相比，XQLD组中出现了23个DEPs的显著上调和72个DEPs的显著下调。

图5 蛋白质组学分析

研究针对模型组与对照组、以及XQLD组与模型组之间的DEP进行了深入的探究，并实施了相应的富集分析。GO分析显示（图6A），与对照组相较，模型组中细胞质翻译成为最为突出的生物学过程（BP），胞质核糖体则是最显著的细胞组分（CC），而核糖体的结构成分则是最关键的分子功能（MF）。与此同时，与模型组相较，XQLD组中心肌收缩的生物学过程（BP）尤为显著，心肌收缩、肌钙蛋白复合物和通道蛋白活性分别占据细胞组分（CC）和分子功能（MF）的突出位置（图6B）。

KEGG富集分析进一步揭示，模型组与对照组中上调的DEP在“吞噬体”、“溶酶体”、“铁死亡”、“核糖体”以及“内质网中的蛋白质加工”等通路中呈现出显著的富集趋势（图6F）。而下调的DEP则主要集中在“紧密连接”、“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“局灶性粘附”、“粘附连接”和“Rap1信号通路”等通路中（图6C）。此外，对比模型组与XQLD组，研究发现上调的DEP主要富集在“NF-κB信号通路”中（图6G），而下调的DEP则在“铁死亡”途径中显著富集（图6D）。

图6 GO和KEGG富集分析

结论

总之，结合网络药理学、蛋白质组学及体内实验，XQLD在NA气道炎症、黏液分泌及气道重塑改善方面的作用机制已被阐明，对未来XQLD在NA治疗领域的应用研究具有参考价值。

参考文献：

Liao G, Yan Q, Zhang M, Zhang X, Yang J, Huang H, Liu X, Jiang Y, Gong J, Zhan S, Li D, Huang X. Integrative analysis of network pharmacology and proteomics reveal the protective effect of Xiaoqinglong Decotion on neutrophilic asthma. J Ethnopharmacol. 2024 Aug 10;330:118102. doi: 10.1016/j.jep.2024.118102