BioTechniques：2014年生物新技术：下一代测序、RCR/克隆、​蛋白分析​、细胞分析

2013年末，BioTechniques杂志围绕下一代测序、RCR/克隆、蛋白分析、细胞分析等技术，展望了它们在2014的发展和突破。

新一代测序

新 一代测序（NGS）技术一路走来，逐渐褪下其神秘面纱，进入越来越多的实验室。随着时间的推移，NGS系统从“高端大气上档次”的大型平台演化成满足个性 化需求的台式测序仪。MiSeq、Ion Torrent和454 GS Junior这些仪器的上市，也推动了测序平台的普及。同时，MiSeqDx测序仪通过美国FDA认证，成为行业内一大里程碑事件，让NGS的临床应用成 为现实。2014年，NGS技术将继续发展，可能会为我们带来更多惊喜。

1.纳米孔测序走出阴影：Oxford Nanopore Technologies公司沉寂了一年之后，终于在11月底启动MinION测序仪的早期试用计划。2014年初，他们会将仪器发送给客户。据称，这个 系统不需要文库制备，成本极低，且读长高达几十kb。这究竟是炒作，还是事实？答案将在明年揭晓。届时我们将看到许多有关纳米孔测序仪的数据。

2.“黑客”改造测序仪：随 着使用的增加，研究人员对测序平台更加得心应手。当然，这也使得他们不再满足于现有的平台，而是尝试打开盖子，调整机器，以满足他们的个性化需求。之前， 我们曾介绍过，麻省理工大学的高手曾成功调整Illumina测序仪，开展单个通道的测序。2014年，这方面的文章估计会越来越多。而这些调整也有望回 到仪器开发者手中，纳入未来的系统更新。

3.应用程序，应用程序，应用程序：你能想象没有App Store的 iPhone 还会大受欢迎吗？同理，没有应用程序和实验手册的测序仪将变得不完整。从2013年开始，我们已经陆续看到有关拓展应用程序的文献出现，我们预计整个 2014 年，开发者们将会想出 NGS 系统的新用途。

4. 新技术？：测 序技术当然不会停滞，新的方法和技术仍在不断涌现。此前，一支研究小组在报道了在石墨烯纳米带上引入纳米孔，这比目前的绝缘膜明显更薄，有望提高纳米孔检 测的速度和灵敏度。此外，单细胞测序也是一个研究热点。近日，一个研究小组在《Nature Biotechnology》上发表文章，介绍了一种新的聚合酶克隆和测序策略，将来可用于单细胞多样性的研究。

虽然备受瞩目的基因组学Archon X奖已被取消，但基因组学研究不会停滞，测序技术仍将继续发展。在未来的一年，我们期待更多让人惊喜的创新。

RCR/克隆

PCR和克隆是我们十分熟悉的技术，熟悉到我们都有些陌生了，不清楚最新的进展。其实，方法开发者一直在努力扩大其用途，近年来也有一些让人吃惊的结果。那么，这些经过时间考验的技术又将会带来一个怎样的未来？也许会是更大、更快、更小。

1. 更大：你 想要将一个DN**段插入载体中？没问题。那么两个片段呢？好吧，难一点，但是也能做到。那五个怎么样？如今我们正走入一个灰色地带；这可能需要一些时 间。随着研究人员在合成生物学等领域的研究愈加深入，他们需要一些克隆方法，以一种简单的方式插入多个DN**段，比如不依赖于连接的克隆（LIC）或 Gibson拼接。

Gibson 拼接是JCVI的Daniel Gibson在2009年发明的新方法。它利用核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶进行拼接，需要相邻的具有重叠序列的DN**段。核酸外切酶从5’ 端降解核苷酸，且不与DNA 聚合酶竞争。双链DNA 被消化产生突出的单链DNA，重叠序列特异性退火，此时，外切酶逐渐热失活。DNA聚合酶和DNA连接酶修复连接成完整的双链 DNA分子，从而实现无痕拼接。这种技术非常高效，而我们有理由相信，2014年在大规模基因拼接上有更多改进。

2. 更快：PCR 需要时间。我们需要反复的变性、退火和延伸，才能产生足够量的产物用于分析。但如果这一过程能够加快而不影响质量呢？在过去几年，随着DNA聚合酶和 PCR仪器的改造，PCR技术已经变得越来越快。然而，随着人们对个性化医疗和基因检测的兴趣日益增加，也希望看到新的快速且高质量的PCR方法。目前， 许多新的测序策略都依赖重新改造的聚合酶，这也预示着迷你PCR的革命。2014年，我们有望看到这些重新改造的聚合酶的更多应用，包括更快的PCR循环 条件，更小、可移动的仪器，将PCR从传统实验室的局限中解放出来。

3. 更小：近两年，单细胞成为大家关注的焦点。尽管我们有大量关于细胞群体的数据，但我们对单个细胞的行为还是知之甚少，比如它如何应对特定的刺激。在2013年，许多研究都关注单细胞水平的生物学，而研究人员也热衷于每次对一个细胞进行研究。

尽 管单细胞分析存在不少挑战；起始材料的量太少，很难确保只有单个细胞。但随着新技术的出现，如数字PCR和微滴式数字PCR，以及微流体技术的改进，研究 人员也开始实现单细胞生物学的探索。到2014年，我们预计单细胞应用的数量会激增，而适用于单细胞的PCR方法也会如雨后春笋般冒出来，带来新的生物学 发现。

今年是PCR技术的“三十岁生日”。这些年来，从PCR到定量PCR再到数字PCR，技术在不断发展，也带来更广泛的应用。下一个三十年，也许PCR会给我们带来更多惊喜。

细胞分析

显微镜技术在过去几年的进步是有目共睹的。我们能够对过去无法成像的结构进行成像，也有了更丰富的颜色可供选择。在这些发展的背后，是工程学和数学的进步，它们让更多颜色和更高分辨率成为可能。那么，在未来的一年，细胞分析又会有哪些新进展呢？让我们来猜猜看。

1. 深入大脑。对 于技术上存在挑战的领域，总是需要足够的资金，来推动开发人员尝试新事物。今年4月，白宫启动了BRAIN计划，其目标是解决一些棘手的显微镜问题，以帮 助神经科学家绘制大脑回路更清晰的图谱。其中之一是将利用MRI等技术获得的大面积图像与数百万个神经元联系起来。从那里，人们需要弄清楚神经元成像与单 分子成像如何关联。最后，这一切都会被拉到单一的数据框架内。这是个巨大的挑战，但是随着更多的开发人员整合成像模式，以加强神经科学的数据集，我们在 2014年有望看到一些重大进展。

2. 超高分辨率显微镜的采集时间更快：2013 年，一些新技术出现，能提高超高分辨率显微镜的图像获取速度。这些进步可能为研究细胞过程的动力学以及在超高分辨率下观察单分子铺平道路。尽管目前仍在开 发的起步阶段，但我们预计明年会出现更多硬件和软件的进步，这将让活细胞超高分辨率显微镜更加强大，也更加普及。

3. 组织样品的深度成像：仪 器开发商已利用试剂让组织迅速变得透明，从而增强显微镜的深度成像应用。在今年年底，一些新的多光子系统也被开发出来，可利用较长的波长实现1000 nm范围及以上的成像，从而尽量减少组织损伤。在2014年，我们有望看到这些平台的进步，以及新的荧光基团，让更深层析的成像和分析成为可能。这一领域 的下一个挑战将是开发新的方法，来处理这些实验所产生的大量数据。

2014年，我们还有望看到细胞分析技术的更多进步，包括干细胞培养和维护的培养基改进；新的自动化平台出现，能快速分离单个细胞；以及细胞分析和成像的集成平台的进一步完善。不过，真正的突破也许是一种全新的技术或方法，这没人可预料。

蛋白分析

近年来，蛋白分析技术在范围（高通量方法）和应用（新颖的蛋白质间相互作用分析方法）上不断扩展。2014年，我们又将看到哪些进展呢？从更好的亲和标签到经过验证的抗体，也许我们能从以下几方面看到蛋白分析技术的进步。

1. 更好的亲和标签：尽管不是最有魅力的方法，但亲和标签仍是蛋白分离中必不可少的。目前，开发者还在不断开发新方法，以期获得更大量的纯净蛋白。随着这些技术的进步，2014年研究人员有望获得更多纯化的蛋白，用于结构测定技术（如冷冻电镜cryo-EM）和蛋白质相互作用分析。

2. 探索复杂的蛋白质相互作用：蛋白质相互作用分析已经走过了漫长的道路，但仍然需要继续进步，以研究体内的蛋白质相互作用和复合物。最近几个月，研究人员利用不同的荧光基团和蛋白标签组合，已经在这方面有所进展。一种流行的方法是利用FK506结合蛋白与雷帕霉素结合域的诱导结合系统。

至 于蛋白复合物，基于超高分辨率显微镜的结构测定已在过去几年快速发展。今年7月，欧洲分子生物学实验室的Jan Ellenberg及其同事在《Science》杂志上发表文章称，他们利用随机超高分辨率显微镜，直接观察了核孔复合物的环状结构。明年，我们有望看到 更多以荧光显微镜为基础的结构测定方法的出现，包括新的和改进的超高分辨率方法以及FRET方法在结构分析上的进步。

3. 抗体验证引发关注：不 完全的抗体验证正成为许多研究人员的错误来源。今年9月，《Biotechniques》杂志上发表了一篇文章。作者称Cdk1的两个市售的单克隆抗体都 是非特异的，与中心体蛋白Cep152有着交叉反应。这种非特异性使得作者之前的蛋白定位研究出现问题。然而，这并非个别现象。类似的情况之前也曾多次出 现。随着科学家对抗体验证日益关注，我们预计2014年会有新的举措来避免这一问题。

有趣的是，对于很多领域，一个方面的发展会推动另一方面。尽管亲和标签已经很成熟，但蛋白质组学其他方面的发展也会推动对增强型标签和蛋白分离方法的需求。此外，随着研究人员向高通量应用迈进，他们也需要一些技术，无需复杂的纯化和分离。2014年，对蛋白科学家而言，也许是富有成效的一年。

原文检索：

Protein Analysis: Looking Through the Crystal Ball

Cell Analysis – Looking through the Crystal Ball

PCR/Cloning – Looking through the Crystal Ball

Next Generation Sequencing: Looking through the crystal ball