IVD前沿丨帕金森病(PD)早期诊断新型生物标志物

帕金森病(PD)以及其他α-突触核蛋白病(如多系统萎缩(MSA))的特征是α-突触核蛋白(α-syn)在大脑和周围神经系统中积聚。考虑到症状的复杂性和异质性，迫切需要一种简单可靠的检测方法，能够准确早期诊断α-突触核蛋白病。MicroRNAs (miRNAs)是调节基因表达和改变代谢途径的小非编码RNA，可以作为多种疾病的调节剂和生物标志物。最近的研究表明，某些病理分子，如Aβ、tau和α-syn，当被包裹在EVs内时，可能会穿过血脑屏障。

近日，杂志Science Advances上发表了一篇题为“Molecular beacon–based detection of circulating microRNA-containing extracellular vesicle as an α-synucleinopathy biomarker”的文章。这项研究对纳米笼式MB(NCMB)探针进行了改进，开发了一种基于纳米级流式细胞术的含有miRNA的EV检测方法，研究结果显示，与PSP（进行性核上性麻痹）或HC相比，PD、MSA或iRBD（孤立性快速眼动睡眠行为障碍）患者血浆中含有miR-44438的EV水平显著升高。PD患者血浆中含有miR-44438的EV水平与H&Y量表呈负相关。一项由88名PD患者组成的纵向队列研究进一步支持了这一结果。平均间隔16.3个月后，血浆中含有miR-44438的EV水平显著下降。这些结果强调了血浆中含有miR-44438的EV作为α-突触核蛋白病早期检测和进展监测的生物标志物的潜力。

图片来源：Science Advances

主要内容

NCMB的构建与表征

分子信标(MBs)是一种具有茎环发夹结构的核苷酸探针，当它们与目标DNA或RNA序列杂交时发出荧光。在本研究中，作者对纳米笼式MB(NCMB)探针进行了改进，将猝灭剂和荧光团包裹在DNA立方体中。当目标miRNA与NCMB结合时，荧光团从立方体中释放出来，而猝灭剂仍然留在立方体中。该检测方法最小化了交叉猝灭效应，并能够在生物液和外泌体中进行目标miRNA的原位分析。NCMB结构示意图如下图所示。简而言之，DNA链(NCMB1、NCMB2、NCMB3、NCMB4、NCMB -assist、NCMB -anchor和NCMB-BHQ2)混合，通过交叉杂交生成DNA支架。然后，将NCMB-cy3链添加到DNA支架上，构建活性NCMB。

NCMB的构建。图片来源：Science Advances

NCMB的表征

miR-44438 - NCMB的cy3荧光强度随着miR-44438浓度呈正相关，且有很强的特异性(图D，E)。接下来使用NCMB检测血浆中含有目标miRNA的EV，证实了该实验的可靠性以及重复性(图G、H)。结果表明，超过一半的含有miR-44438的EV来源于神经元。

NCMB的表征。图片来源：Science Advances

血浆miR-44438 EV浓度的组间比较

作者比较了302例PD患者、119例MSA患者、21例PSP患者和276例HC的血浆miR-44438阳性EV浓度。在控制年龄、性别和体重指数(BMI)的情况下，PD或MSA患者血浆中含有miR-44438的EV浓度明显高于PSP或HC(图C)，且在区分PD和HC方面具有很高的准确性，AUC= 0.947(图D)，用于区分MSA和HC，AUC = 0.912(图D)。区分PSP与HC的AUC为0.816(图D)。

PD患者和HC患者之间的差异在一个包括208名PD患者和217名HC的多中心验证队列中得到了验证。PD患者血浆中含有miR-44438的EV浓度明显高于HC(图E)， AUC为0.909(图F)。

血浆miR-44438 EV浓度的组间比较。

图片来源：Science Advances

血浆中含有miR-44438的EV浓度与PD患者人口学和临床特征的相关性

作者分析了血浆中含有miR-44438的EV浓度与人口统计学和临床特征的相关性，包括PD患者的年龄、性别、病程、迷你精神状态检查(MMSE)评分、蒙特利尔认知评估(MoCA)量表、Hoehn-Yahr (H&Y)量表、运动障碍学会统一帕金森病评定量表第三部分(MDS-UPDRS III)、左旋多巴当量日剂量(LEDD)和BMI。结果显示，血浆中含有miR-44438的EV浓度与年龄， H&Y量表， BMI呈显著负相关。血浆中含有miR-44438的EV浓度与发病年龄存在显著但较弱的相关性（下图a）。

PD患者中含miR-44438的EV水平的相关性分析。

图片来源：Science Advances

纵向PD队列血浆中含miR-44438 EV浓度的变化

为了进一步研究含miR-44438的EV水平与疾病进展的相关性，接下来在包括88例PD患者的纵向队列中测试了含miR-44438的EV水平的变化。发现血浆中含有miR-44438的EV水平显著降低(图D)，平均间隔时间为16.3个月。尽管含miR-44438的EV水平随着PD的进展而下降，但与HC相比，PD患者随访时的EV水平仍明显较高。

PD患者中含mir-44438的EV水平的纵向研究。

图片来源：Science Advances

早期PD患者血浆中含miR-44438的EV浓度

考虑到PD患者血浆中miR-44438的EV水平可能在PD晚期降至HC范围，这可能会削弱此生物标志物作为PD诊断生物标志物的功效。但PD的精确诊断主要在早期具有挑战性。血浆中含有miR-44438的EV水平对诊断H&Y≤2.5的PD患者的疗效优于区分所有PD患者和HC患者，AUC从0.935增加到0.951(图C)。同样，区分病程≤5年PD患者与HC患者的AUC为0.945(图E)，鉴别病程>5年PD患者与HC为0.922(图E)。

含血浆miR-44438的EV对早期PD的诊断性能。

图片来源：Science Advances

iRBD患者中含有miR-44438的EV水平的验证

iRBD通常被认为是α-突触核蛋白病的前驱期。作者测试了血浆中含有miR-44438的EV浓度是否可以区分iRBD患者和HC患者。结果显示，iRBD患者的这种生物标志物明显高于HC(图A)，AUC为0.709(图B)。

iRBD患者血浆中含mir-44438的EV水平。

图片来源：Science Advances

总结和讨论

这项研究开发了一种基于纳米级流式细胞术的含有miRNA的EV检测方法，研究结果显示，与PSP或HC相比，PD、MSA或iRBD患者血浆中含有miR-44438的EV水平显著升高。然而，PD与MSA之间无显著差异。值得注意的是，PD患者血浆中含有miR-44438的EV水平与H&Y量表呈负相关。通过一项由88名PD患者组成的纵向队列研究进一步支持了这一结果。平均间隔16.3个月后，血浆中含有miR-44438的EV水平显著下降。

这项研究也有局限性。首先，纳米级流式细胞术检测不能提供精确的EV大小分布，难以检测110 nm下的外泌体，可能会忽略组间含miR-44438的小外泌体的变化。其次，该生物标志物不能有效区分PD和MSA，这是α-突触核蛋白病的一个关键诊断难题。此外，未来的研究有必要在更广泛的队列中验证这一发现，包括PSP患者和其他非突触核蛋白病相关疾病的个体，以及进行跨种族验证，以更确切地确定该生物标志物的重要性和更广泛的适用性。

总之，这些结果强调了血浆中含有miR-44438的EV作为α-突触核蛋白病早期检测和进展监测的生物标志物的潜力。