Microbiome：绿茶多酚之所以能减轻炎症性肠病，原来靠它们！

炎症性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎症性疾病，临床上主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。近年来，IBD在全球范围内变得越来越普遍。事实上，IBD与肠道菌群调节障碍相关，最近对肠道菌群及其代谢物的调控，如粪便菌群移植(FMT)，在治疗IBD方面也表现出相当潜力。此外，大量流行病学证据支持日常饮食影响慢性疾病(如IBD)的风险，目前研究表明，绿茶的主要生物活性成分——表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对缓解IBD有益。然而，EGCG减轻IBD时，肠道微生物群是否及如何发挥作用尚不清楚。而这将是本研究的主要目的。

本研究首先测试口服或直肠给药EGCG对于右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型的缓解作用。接下来，通过添加EGCG预处理小鼠肠道微生物群探索其在结肠炎中的抵抗作用。最后通过与粪便微生物移植(FMT)处理小鼠及无菌粪便平酯(SFF)处理小鼠对比，证明了EGCG处理供体特异性肠道微群的缓解作用。

1、口服而非经直肠EGCG可缓解DSS诱导的结肠炎

如图2b-e所示，与DSS组相比，口服EGCG干预显著缓解DSS诱导结肠炎，表现为疾病活动指数评分显著降低，减少体重减轻，结肠缩短缓解。然而，经直肠输注EGCG未能改善上述任何测量值。组织学分析进一步显示，口服后，结肠内炎性细胞浸润和黏膜损伤明显减弱，结肠总组织学评分明显降低(图2f和g)，但经直肠EGCG未见变化。

血浆和结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)和促炎细胞因子测量结果进一步说明EGCG对全身和肠道炎症反应的影响。口服EGCG后，DSS处理小鼠中IL-1β(图2h)、IL-6(图2i)、IL-8(图2j)和TNF-α(图2k)的血浆浓度显著降低。相反，经直肠EGCG未能抑制血浆中的这些细胞因子。DSS显著降低小鼠结肠中MPO的浓度，但口服EGCG可显著降低这种浓度(图2l)。此外，口服和直肠EGCG均显著降低结肠中IL-6水平(图2m)， TNF-α也显示出强烈下降趋势(图2n）。然而，直肠EGCG未能降低DSS处理小鼠结肠中MPO的水平。

综上，这些结果表明口服EGCG而非直肠EGCG，可改善临床结肠炎症状和结肠损伤。

2、口服EGCG可抑制DSS诱导的肠道黏膜的氧化应激，改善屏障功能

通过测定血浆和结肠总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽/ 氧化酶(GSH-px)和丙二醛(MDA)，探讨EGCG对氧化应激的影响。与正常对照组相比，口服EGCG可显著抑制结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT的浓度，增加MDA的水平(图3a, b和c)。然而，与正常对照组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT浓度的抑制并没有受到直肠EGCG的明显影响，尽管MDA水平也降低了。DSS显著降低T-AOC和 T-SOD的结肠浓度 ，但通过口服 EGCG 减弱为正常水平（图3d和e）。值得注意的是，与正常组的结肠相比，直肠 EGCG 的 GSH-px 水平显著增加。然而，口腔和直肠EGCG对减少凋亡没有明显效果。阿利新蓝染色中可见DSS显著降低了结肠上皮黏膜的厚度，口服EGCG可将这种影响减到正常(图3k)。

这些结果表明，口服而非直肠EGCG可抑制DSS诱导的氧化应激，并减弱DSS损伤的粘膜屏障功能。

3、口服EGCG可调节肠道菌群的组成和SCFAs的产生

在结肠炎小鼠中，口服EGCG和直肠EGCG均未影响Alpha多样性(图4a)。PCoA显示，正常对照组和结肠炎小鼠的肠道微生物群结构分离(R²=0.337, P=0.001, Fig. 4b; R2=0.360, P=0.001,）。肠道微生物群结构分离也表现在DSS + 口服-EGCG组和DSS + 口服-PBS组（R²=0.124, P=0.028），表明结肠炎小鼠的肠道微生物群结构受到口服EGCG的显著影响。此外，直肠EGCG对粪便菌群结构有显著影响（R2=0.136,P=0.011）。在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是粪便菌群中的优势门(图4c)。通过LEfSe分析，在 DSS 小鼠中，口服或直肠 EGCG 的粪便细菌分类量差异最大。

为了进一步探讨口服或直肠EGCG对SCFAs产生的影响，我们测量了粪便中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。DSS显著降低了所有三种SCFAs，但口服EGCG显著提高了丙酸和丁酸的产量(图4f、g和h)，而直肠EGCG没有提高，在dss处理的小鼠对直肠EGCG的反应中，丁酸产量进一步显著减少。

进一步进行Spearman相关性分析表明，阿克曼氏菌分别与血浆CAT水平(R> 0.52, P < 0.05)， 结肠T-AOC水平(R> 0.63, P < 0.05)和粪便醋酸 (R> 0.56, P < 0.05) 和丁酸(R> 0.65, P < 0.01) 显著正相关，与血清IL-8水平呈显著负相关(R< −0.61, P < 0.05)（图4i）。而结肠炎组中富集的乳酸菌与结肠TNF-α水平呈强负相关 (R< −0.59, P < 0.05)。

以上结果说明，肠道微生物群的改变和结肠炎小鼠SCFA的增产是针对口服EGCG，但不是直肠EGCG，这表明肠道微生物群在缓解DSS引起的结肠炎方面可能起着关键作用。

4、预防性补充EGCG减轻DSS引起的结肠炎

预防性EGCG缓解了DSS治疗的小鼠结肠炎的症状，疾病活动指数显著下降（图5b） 和体重下降缓解（图5c），并结肠长度增长（图5d 和 e）。组织学分析进一步揭示，预防性EGCG抑制DSS诱发的炎症细胞渗透和对结肠粘膜的损害（图5f 和 g）。此外，预防性EGCG降低结肠炎小鼠中IL-1（图5h）， IL-6 （图5i）， IL-8 （图5j）， 和 Tnf - α （图5k）的血浆水平。引人注目的是，通过预防性补充EGCG，DSS 提升的 MPO （图5l）， IL-6 （图5m）， 和 Tnf - α （图5n） 水平在很大程度上衰减到正常水平。

这些结果共同表明，预防性补充EGCG能够抑制DSS引起的结肠炎症状、损伤和炎症。

5、预防性补充EGCG可降低DSS诱发的氧化应激和凋亡，改善粘膜屏障功能

预防性EGCG很大程度上降低了血浆中抗氧化酶、T-SOD和CAT的水平，而DSS显著降低了这些水平(图6a和b)。与此一致的是，DSS显著增加了血浆中的MDA，但在预防性EGCG的作用下降至正常水平(图6c)。同样，DSS可显著降低结肠中T-AOC(图6d)、T-SOD(图6e)、CAT(图6f)和GSH-px(图6g)水平，但预防性EGCG可使其基本恢复到正常水平。结肠MDA水平显著升高，但在预防EGCG的作用下降至正常水平以下(图6h)。值得注意的是，补充EGCG前甚至在健康小鼠的血浆和结肠中引发了明显的抗氧化反应(图6a-h)。TUNEL分析进一步发现，DSS显著增加了结肠黏膜中凋亡细胞的频率，而预防性EGCG则大大扭转了这一趋势(图6i和j)。此外，预防性EGCG还能减弱dss损伤的结肠黏液和结肠屏障的精细结构(图6k和l)。

结果提示，预防性补充EGCG能够抑制dss诱导的氧化应激，调节细胞凋亡，恢复结肠黏膜屏障功能。

6、预防性补充EGCG调节肠道菌群组成及其SCFAs的产生

与其他三组相比，EGCG组ASV水平sob指数显著升高(p < 0.01，图7a)。PCoA分析显示，对照组和dss处理组之间有明显的分离(R2=0.479, P=0.001，图7b)。预防性EGCG对con组和EGCG组肠道菌群组成有显著影响(R2=0.173, P=0.001)， DSS组和EGCG+DSS组肠道菌群组成有显著影响(R2=0.231, P=0.001)。值得注意的是，健康小鼠口服EGCG可导致包括阿克曼氏菌在内的13个细菌属的富集，而正常对照组中只有4个分类群富集(图7e)。此外，在经EGCG预处理的结肠炎小鼠中富集了8个菌属，而仅在dss组中富集了另外6个菌属(图7f)。此外，在dss处理的小鼠中，预防性EGCG完全逆转了包括乙酸(图7g)、丙酸(图7h)和丁酸(图7i)在内的SCFAs衰减。结果显示，DSS处理小鼠的14个细菌属与血浆和结肠中抗氧化或促炎介质的浓度或粪便中SCFAs的浓度显著相关(p < 0.05)。

特别是阿克曼氏菌与血浆T-SOD (R<0.59,P<0.05)、CAT (R<0.52, P<0.05)、结肠TNF-α (R<0.52,P<0.01)、MPO (R<0.59,P<0.05)、粪便乙酸(R<0.55, P<0.05)、丙酸(R<0.55, P<0.05)、丁酸(R<0.50, P<0.05)呈正相关。与血浆MDA (R<−0.60,P<0.05)和结肠T-AOC水平(R<−0.81,P<0.01)则呈负相关(图7k)。

综上所述，预防性EGCG可调节肠道菌群组成及其代谢，从而有可能减弱DSS诱导的肠道菌群失调。

7、EGCG - FMT比CON - FMT和EGCG - SFF更有助于缓解结肠炎

与其他三组相比，EGCG-FMT治疗的结肠炎小鼠体重和结肠长度增加更多，DAI和组织学损伤减少(图8b-g)。此外，与其他三组相比，EGCG-FMT治疗的结肠炎小鼠的血浆中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平下降(图8h-k)，结肠中IL-6和TNF-α水平下降，MPO水平升高(图8l-n)。值得注意的是，与CON-SFF小鼠相比，EGCG-SFF也更深刻地缓解了急性结肠炎的症状，变现为体重减轻更少，DAI评分更低，结肠长度增加(图8b-g)。此外，与CON-SFF相比，EGCG-SFF可降低血浆IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平(图8h-k)，以及结肠IL-6、TNF-α水平(图8h, m)。

8、EGCG - FMT比CON - FMT和EGCG - SFF更有助于减轻结肠屏障损伤

与其他三组相比，EGCG-FMT结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT浓度升高，MDA浓度降低(图9a-c)。此外，与其他三组相比，EGCG-FMT结肠炎小鼠结肠中T-SOD和GSH-PX浓度升高， MDA浓度降低(图9e-h)。同时，与CON-FMT或EGCG- SFF相比，EGCG处理小鼠的微生物群促进了结肠炎小鼠的细胞凋亡，并保持了更好的黏液分布和结肠紧密连接的完整性(图9i-l)。值得注意的是，与CON-SFF相比，EGCG-SFF小鼠表现出相似的差异，表现为血浆中CAT水平升高，结肠中T-SOD和GSH-PX水平升高，血浆和结肠中MDA水平降低(图9a-h)。EGCG-SFF也可促进结肠上皮细胞凋亡(图9i和j)。

9、EGCG - FMT促进了短链脂肪酸产生菌的富集和随后的短链脂肪酸的产生

在有结肠炎的小鼠中，FMT或SFF对ASV水平sob指数没有明显影响(图10a)。PCoA分析显示四组之间(R2=0.169, P=0.003，图10b)、两组FMT之间(R2=0.094, P=0.099)、两组SFF之间(R2=0.065, P=0.406)以及CON-FMT和CON-SFF之(R2=0.148, P=0.015)的结构变化。EGCG-FMT组和EGCG-SFF组的结构明显不同(R2=0.226, P=0.001)。值得注意的是，EGCG-FMT显著富集了阿克曼氏菌(图10e)。EGCG-FMT在结肠炎小鼠体内的粪便SCFA（醋酸盐、丙酸酯和肉酸盐）的产量显著增加，而其他三组的SCFA的产量没有受到EGCG-SFF的显著影响。10f、g、 h）。

总的来说，与CON-FMT或EGCG-SFF相比，EGCG-FMT对结肠炎小鼠结肠炎和结肠屏障损伤的缓解作用更明显。与我们的治疗和预补充试验一致，EGCG-FMT也诱导了丰富的阿克曼氏菌和增加SCFAs的产生，这表明EGCG剂量小鼠肠道微生物群对结肠炎的缓解作用。

综上所述，口服而非经直肠补充EGCG可缓解DSS诱导的结肠炎，而它们对肠道菌群的组成和代谢产物的不同影响，暗示了肠道菌群在介导有益作用方面的中心作用。考虑到EGCG处理小鼠的微生物群的缓解作用，本研究认为EGCG对IBD进展的减缓主要是通过产生SCFAs的细菌，特别是阿克曼氏菌和随后产生的功能性SCFAs发挥作用。这些肠道微生物群的变化通常会导致保护性短链脂肪酸（如丁酸盐）的产生增加，而丁酸盐反过来会引发明显的抗氧化、抗炎和增强屏障作用，导致肠道炎症和损害的减缓（图11）。这些发现为EGCG介导的IBD缓解提供了新的见解，并将促进IBD和其他炎症性疾病的治疗和预防策略的发展。

原文来源：

Wu et al.Gut microbiota from green tea polyphenol-dosed mice improves intestinal epithelial homeostasis and ameliorates experimental colitis. Microbiome (2021) 9:184
https://doi.org/10.1186/s40168-021-01115-9