【Leukemia】综述：利用CRISPR基因编辑技术优化CAR-T细胞治疗的有效性、安全性和可及性

CRISPR基因编辑

CAR-T细胞疗法彻底改变了肿瘤免疫治疗的现状，但不佳的疗效与可及性，以及不良事件仍在一定程度上掣肘了CAR-T疗法的临床应用和发展。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术可有效执行定向整合、多基因编辑、全基因组功能调控等多种功能。此外，利用大规模引导RNA （large-scale guide，gRNA）遗传扰动进行CRISPR筛选，为理解CAR-T细胞抗癌疗效的机制提供了一种无偏倚的方法。目前开发的多种新兴的CRISPR工具兼具高特异性、可控性和高效性，这些工具将在CAR-T细胞编辑和新靶点识别中发挥巨大作用。

《Leukemia》近日发表综述，总结了CRISPR系统在改善CAR-T疗法临床应用方面的潜在用途，包括优化疗效和安全性，开发通用CAR-T细胞，还讨论了CRISPR编辑技术面临的挑战及解决方案，同时突出CAR-T细胞治疗的未来研究方向。通讯作者为帝国理工学院Robert Peter Gale教授和北京同仁医院王亮教授。现整理主要内容供参考。

CRISPR编辑系统的机制和优势

锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）依靠蛋白质结构域识别目标序列，构建过程繁琐费力，而CRISPR编辑技术将复杂的蛋白质工程问题转变为RNA编码问题，迅速成为基础研究和临床应用极具吸引力的工具。在基本的CRISPR-Cas系统中，如Cas9，Cas核酸酶由sgRNA引导并定向到靶标，切割目标DNA生成双链断裂（DSB），而后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）等内源性途径修复DSB，实现基因敲除或供体基因写入。

CAR-T疗法中的CRISPR工具

目前，已经开发出大量高性能且具有特定功能的CRISPR基因编辑工具，其中包括II型、V型和VI型在内的二类系统获得了最多的关注和应用。属II型系统的Cas9是首个被开发用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统。Cas9蛋白在gRNA引导下产生目标DNA的双链断裂（DSB）。通过递送一种形式的Cas9蛋白和多种sgRNA，CRISPR系统即可同时靶向多个基因。类似地，属V类CRISPR系统的Cas12a也通过产生DSB进行基因编辑，但其识别的PAM序列不同，且拥有精简的结构和更低的脱靶率。CRISPR干扰（CRISPRi）或CRISPR激活（CRISPRa）分别由dCas9与转录抑制因子或转录激活因子融合而成，从而具备转录调控功能。Cas13d能够靶向切割RNA，从而在转录组水平上调控基因表达。此外，Cas13d不受原间隔器侧翼序列（protospacer flanking sequence，PFS）的限制，几乎可以靶向任何RNA序列，具有广泛的编辑范围。碱基编辑器（BE）通过结合nCas（Cas nickase）和脱氨酶结构域，可催化靶标链的单个核苷酸突变。先导编辑器（PE）由一个融合了逆转录酶结构域的nCas组成，其引物编辑向导RNA（pegRNA）在3'端包含所需序列的模板以及靶特异性间隔序列，可实现DNA片段编辑。

CRISPR用于CAR-T的优势

CRISPR系统在CAR-T细胞治疗中的应用主要包括位点特异性整合（定向整合）和多基因编辑。通过DSB的HDR修复途径可将CAR供体模板精确整合到不同的目标基因位点中，如TRAC。定向整合实现了knocking in和knocking out的“一石二鸟”基因编辑效果，更重要的是避免了病毒载体随机整合的致癌风险。由于负责DNA切割的Cas蛋白均为同一形式，因此只需根据靶位点设计相应的gRNA，使Cas酶与各种gRNA在细胞内同时表达，从而达到多基因靶向编辑的目的。通过电穿孔或脂质颗粒包封，可以将Cas mRNA和gRNA或预形成的核糖核蛋白复合物（RNP）直接递送到细胞内。瞬时表达CRISPR编辑系统具有成本低、off-target概率低、无病毒载体致癌突变风险等诸多优点。

CRISPR筛选

高通量CRISPR筛选作为一种无偏见的靶标发现平台，为表征CAR T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用提供了全面的工具。CRISPR筛选涉及将构建好的sgRNA文库转导到细胞群体中，然后根据每个细胞接收到的个别sgRNA进行特定扰动。在应用特定筛选标准后，从基因扰动的细胞群体中选择感兴趣的表型细胞群进行读数和sgRNA测序，从而识别潜在的正向和负向驱动因素。此外，可以将与研究目标相关的已知基因组合在一起，构建多基因crRNA阵列文库，筛选具有协同基因组合的细胞群体，以获得T细胞的改进优化方案。根据基因扰动策略的不同，CRISPR筛选可分为功能缺失（loss-of-function，LOF）筛选和功能获得（gain-of-function，GOF）筛选。CAR-T细胞功能靶点鉴定常用的方法为通过电穿孔将Cas9蛋白引入T细胞池，并将慢病毒sgRNA文库转导到T细胞池中，而GOF筛选则是使用慢病毒将dgRNA文库包装到表达Cas9的T细胞中。新发现的靶标已通过基因敲除或激活在CAR-T细胞中得到验证，也可直接在CAR-T细胞池中进行CRISPR筛选验证。在表达cas9的肿瘤细胞中，引入sgRNA慢病毒文库并通过标记物表达或CAR-T细胞免疫攻击进行筛选，可以鉴定肿瘤免疫逃逸机制和靶向CAR-T细胞治疗的耐药基因。

CRISPR在CAR-T中的应用

优化CAR-T细胞的效能。肿瘤微环境（TME）中的抑制通路、相关细胞或缺氧引起的免疫抑制以及T细胞的表观遗传改变都可能导致T细胞耗竭，降低其效应功能。因而利用CRISPR系统敲除免疫检查点、TME应答受体等分子，可以最大限度地发挥CAR-T细胞治疗恶性肿瘤的疗效。利用CRISPR系统消除细胞因子、炎性因子、CAR分子表达的负调控分子也可提高疗效。通过CRISPR筛选，更多调节CAR-T细胞抗肿瘤活性的潜在靶点正被发掘。

规避CAR-T细胞治疗的不良事件。GM-CSF敲除的CAR-T细胞可以有效缓解CRS和ICANS，而去除T细胞表面的共享抗原（CD7、CD5）和HPSC上的CD33可避免on-target off-tumor毒性。

CRISPR在通用型CAR-T中的应用

自体T细胞质量参差不齐、制造工艺复杂、生产周期长以及成本高昂，为临床应用带来诸多挑战。通用CAR T细胞（UCAR-T），也被称为“现成的”CAR T细胞，产品源自健康供体，制备期间可能经历多个基因编辑过程，当前正被广泛研究和开发用于大规模生产。UCAR-T产品有望克服自体CAR-T细胞的相关问题，在安全性、疗效和可负担性方面实现可及。

UCAR-T细胞与CAR-T细胞的主要区别在于供体的来源为健康供体衍生的同种异体T细胞，而非自体T细胞。这要求UCAR-T细胞在临床应用中解决免疫排斥的挑战。首先是安全性，因为同种异体CAR T细胞攻击宿主组织可能导致危及生命的移植物抗宿主病（GVHD）。其次是疗效，因为同种异体CAR-T细胞可能被宿主免疫系统清除，导致宿主抗移植物排斥反应（HVGR）。敲除内源性αβ TCR可预防GVHD，敲除HLA I类和II类分子以预防HVGR（分别通过删除B2M/HLA-A、B和CIITA）。实现持久性的其他方式：敲除CD52（可使细胞在alemtuzumab清淋的情况下持续存在），敲除NK细胞激活剂脊髓灰质炎病毒受体（PVR），添加NK细胞抑制剂（如HLA-E、HLA-G、CD47和CD300a TASR）来抵抗NK细胞攻击。破坏程序性细胞死亡蛋白1 （PD-1）也可增强UCAR-T细胞对抗肿瘤免疫抑制。

通用型CAR-T中的临床试验

经CRISPR系统编辑的UCAR-T相关临床试验正在广泛展开。这些试验大多集中在各种血液恶性肿瘤上，而在实体瘤中的临床进展仍处于早期阶段。其中，应用最广泛的UCAR T疗法仍然是针对B细胞恶性肿瘤的CD19靶向治疗，已有近20款CRISPR编辑生产的产品开启了临床研究。公开试验数据显示，针对B细胞或T细胞系白血病的UCAR T疗法疗效最佳，其完全缓解（CR）或不完全计数恢复的CRi的比例在60%到85%之间，而除零星的病例存在低等级的GVHD外，绝大部分试验都未观察到GVHD。CRS等不良事件比较常见，但经单抗治疗后都能实现有效的副作用管理。总体而言，经CRISPR系统编辑的UCAR-T细胞在预防GVHD方面表现出令人鼓舞的安全性，在血液恶性肿瘤中表现出有效的抗肿瘤活性。而在疗效方面，整体上仍达不到自体CAR-T细胞疗法的疗效。值得注意的是，供体来源的T细胞具有更强的耐受性，可以进行多重基因编辑。这为探索更多旨在提高细胞持久性和疗效的基因改造提供了机会。

CRISPR在CAR-T中的挑战及对应策略

不良事件及可行的解决方案。Off-target突变是由于基因组的相似性，sgRNA识别到基因组中的脱靶位点导致Cas蛋白意外切割引起的。由于CRISPR系统的脱靶效应主要由靶点特异性、染色质状态以及核酸酶的性质和浓度决定，因此主要方法是提高CRISPR系统识别的特异性和准确性。选择高保真度的工程化核酸酶或二聚体系统可以提高DNA切割的准确性，减少Cas依赖的靶外效应。例如，Cas-CLOVER和“spacer-nick”。染色体畸变（如大的缺失和易位）是常见现象。这里显示了染色体丢失和易位的可能实例。导致染色体畸变的关键因素是DSB的产生，Base editors（BE）在多个位点上进行精确的单碱基替换，从而实现无DSB基因编辑，以降低基因重排的风险。

传统的递送方法包括病毒载体和电穿孔。病毒载体主要有LV、AV和AAV，病毒载体递送将使CRISPR组分组成性表达，这可能增加Off-target风险。同时，病毒载体还存在免疫原性、载货量受限、转导效率较低等缺点。CAR-T细胞中的电穿孔递送可能导致细胞损伤，潜在解决方案有控制电流大小，抑制caspase-3表达，调节缓冲液渗透压，共电穿孔RNP和长双链DNA或使用单链DNA模板等。肽递送是一种新兴的CAR-T细胞CRISPR组件递送系统。脂质纳米粒子（LNP）和病毒样颗粒（VLP）具有体内给药的潜力，但在体内能否靶向适宜的细胞类型、避免细胞损伤和免疫排斥，还需要进一步考虑。

总结

总的来说，CRISPR 系统为解决 CAR-T 细胞疗法在疗效、安全性和可及性方面的重大挑战提供了一种新颖的方法。基于 CRISPR 系统开发的 CAR-T 细胞疗法有机结合制备和优化，密切联动基础与临床，为设计和应用 CAR-T 免疫疗法满足不断提高的临床需求提供了有力的基础和机会。

参考文献

Lei, T., Wang, Y., Zhang, Y. et al. Leveraging CRISPR gene editing technology to optimize the efficacy, safety and accessibility of CAR T-cell therapy. Leukemia (2024). https://doi.org/10.1038/s41375-024-02444-y